[发明专利]一种含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法

说明书

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法。所述方法包括以下步骤：具有遗传稳定性谷氨酸脱羧酶工程菌的构建或选育；将所得工程菌进行种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，于2000L发酵罐中进行发酵；发酵过程中控制发酵液溶氧量，通气量和pH；流加碳源和氮源。本发明方法通过采用具有遗传稳定性的谷氨酸脱羧酶重组菌，适宜的发酵培养基和高密度发酵工艺，实现了2000 L工业化发酵生产，生产所得γ‑氨基丁酸浓度可以达到539.8g/L，谷氨酸脱羧酶酶活高达661.5U/mL。

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统中重要的抑制性神经传导物质，主要存在于脑和骨髓中。γ-氨基丁酸具有多种生理功能，包括镇静、抗惊厥、治疗癫痫病；改善肝脏、肾脏功能；降低血压；调节激素分泌；延缓衰老；增强记忆；提高生殖活性；能促进胰岛细胞中胰岛素的分泌，有效地预防糖尿病。此外，γ-氨基丁酸还具有其它一些生理功能，如预防肥胖，促进酒精代谢，调节心律失常，防止动脉硬化以及防止皮肤老化等作用。γ-氨基丁酸还能够治疗尿毒症以及一氧化碳中毒。

采用谷氨酸脱羧酶或能够生产谷氨酸脱羧酶的微生物全细胞脱去L-谷氨酸的α-羧基可生产得到γ-氨基丁酸。谷氨酸脱羧酶或能够生产谷氨酸脱羧酶的微生物全细胞的工业化生产是实现GABA规模化生产的一个重要途径。目前研究多集中于谷氨酸脱羧酶工程菌的构建或小试发酵方法的研究。如专利申请CN110734904A公开了一种生产谷氨酸脱羧酶的方法以食品级枯草芽孢杆菌为宿主构建得到了可表达谷氨酸脱羧酶的重组枯草芽孢杆菌；利用此重组枯草芽孢杆菌可生产得到食品级谷氨酸脱羧酶以及食品级γ-氨基丁酸。中国发明专利CN104099366B公开了一种谷氨酸脱羧酶重组质粒及其构建方法，所述重组质粒是通过将谷氨酸脱羧酶基因gadB与麦芽糖启动子pamyE拼接后，插入到穿梭表达载体pEKEx2中形成的重组质粒pEKEx2-pamyE-gadB。中国发明专利CN112391372A公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌通过蛋白质工程改造植物乳杆菌源的谷氨酸脱羧酶，拓宽了该蛋白催化pH活性范围；改造后的GadB基因与GadC基因共同连接于pNZ8149载体中，在乳酸乳球菌NZ3900中表达；在发酵罐中培养重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-gadBΔC11C，用于转化谷氨酸钠生产食品级GABA。然而该方法仍处于小试发酵(2L)阶段。

目前尚未有关谷氨酸脱羧酶或能够生产谷氨酸脱羧酶的微生物全细胞工业化发酵生产的报道。

发明内容：

本发明主要目的在于提供一种谷氨酸脱羧酶和/或含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法。本发明方法通过采用具有遗传稳定性的谷氨酸脱羧酶重组菌，适宜的发酵培养基和高密度发酵工艺，实现了2000L工业化发酵生产，生产所得谷氨酸脱羧酶酶活高达661.5U/mL。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种谷氨酸脱羧酶和/或含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法，其包括以下步骤：

具有遗传稳定性谷氨酸脱羧酶工程菌的构建或选育；将所得工程菌进行种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，于2000L发酵罐中进行发酵；发酵过程中控制发酵液溶氧量，通气量和pH；流加碳源和氮源。

进一步地，所述工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为载体，表达谷氨酸脱羧酶GadB基因，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。