[发明专利]一种鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR引物对和探针组及试剂盒、方法

权利要求书

1.一种鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR引物对和探针组，其特征在于，所述引物对和探针组是基于猪伪狂犬病毒gC基因保守区域设计得到，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR引物对和探针组，其特征在于，所述探针的荧光素标记为FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。

3.根据权利要求1所述鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR引物对和探针组，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1。

4.一种鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述引物对和探针组。

5.根据权利要求4所述鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括20μl实时荧光PCR反应体系的试剂：第一PCR扩增液18μl和待测DNA模板2μl，第一PCR扩增液中，Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT、甘油、Tween-20和甲酰胺含量分别为0.25U/μl、10mM、0.05mM、0.05mM、30％V/V、0.1％V/V、0.5％V/V，核苷酸序列如SEQID NO.3所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物浓度为10μM，dNTPs2.5mM。

6.根据权利要求5所述鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述实时荧光PCR的反应条件为：95℃30sec循环一次；之后40个循环，每个循环为95℃5sec，60℃30sec；每个循环的第二步收集荧光信号。

7.根据权利要求4所述鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的下游引物。

8.根据权利要求7所述鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括20μl普通PCR反应体系的试剂：第二PCR扩增液18μl和待测DNA模板2μl，第二PCR扩增液中，Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT、甘油、Tween-20和甲酰胺含量分别为0.25U/μl、10mM、0.05mM、0.05mM、30％V/V、0.1％V/V、0.5％V/V，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物浓度为10μM，dNTPs2.5mM。

9.一种鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、根据gC基因保守区域设计核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物，通过PCR扩增电泳条带的大小鉴别出包括PRV基因I型和PRV基因II型的所有伪狂犬病毒毒株；

步骤二、在PRV基因I型21个核苷酸缺失处设计实时荧光PCR探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，分别在上下游设计特异性引物，特异性引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物，通过实时荧光PCR扩增，对步骤一鉴别出的所有伪狂犬病毒毒株进行检测，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准；当Ct值≤35，且出现特异性扩增曲线，表明样品中含有基因II型猪伪狂犬病毒；当无Ct值并且无特异性扩增曲线，表明样品中含有基因I型猪伪狂犬病毒。