[发明专利]一种鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR引物对和探针组及试剂盒、方法

说明书

本发明提供了一种鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR引物对和探针组及试剂盒、方法，所述引物对和探针组是基于猪伪狂犬病毒gC基因保守区域设计得到，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明在PRV基因I型21个核苷酸缺失处设计实时荧光PCR探针，分别在上下游设计特异性引物，建立可鉴别PRV基因I型与基因II型的实时荧光PCR方法，具有灵敏度高、特异性好等技术优势。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR引物对和探针组及试剂盒、方法。

背景技术

伪狂犬病毒(PRV)是一种可引起家畜和多种野生动物共患的急性传染病，严重危害我国生猪产业健康发展。PRV可分成基因I型和基因II型，PRV基因I型主要为国外毒株，目前我国养殖业使用的PRV疫苗毒株也主要为基因I型，而基因II型为我国主要流行的野毒株，I型毒株疫苗对国内当前流行株(II型)不能完全保护。因此，区分PRV基因I型和基因II型方法的建立可为掌握我国PRV疫苗毒株和野毒株的流行情况及分子遗传变异提供鉴别检测手段。

PRV基因组为线性双链DNA，全长约150k，包括独特长区域(Unique longsequence,UL)和独特短区域(Unique short sequence,US)，US两侧分别具有末端重复序列(Terminal repeat sequence,TRS)和内部重复序列(Internal repeat sequence,IRS)。PRV基因组有70个编码基因，基因序列GC含量高达70％以上。通过分析大量PRV基因I型和基因II型毒株的全基因序列，发现PRV gC基因相对保守，但PRV基因I型毒株在gC基因上存在特征性的21个核苷酸缺失。目前，国内外常用的实验室检测伪狂犬病毒的方法主要包括病毒分离、兔体接种实验、抗体检测、病原学检测、分子生物学方法等几大类，其中实时荧光定量PCR检测技术以其快速、简便、准确等优点成为快速发展的检测手段。然而，目前尚没有建立一种可实现有效鉴别PRV基因I型和基因II项毒株的实时荧光PCR检测手段。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR引物对和探针组及试剂盒、方法，目的是实现PRV基因I型和基因II项毒株的鉴别。

基于上述目的，本发明提供了一种鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR引物对和探针组，所述引物对和探针组是基于猪伪狂犬病毒gC基因保守区域设计得到，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述探针的荧光素标记为FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。

所述探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1。

本发明还提供一种鉴别不同基因型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR试剂盒，包括所述引物对和探针组。

所述试剂盒包括20μl实时荧光PCR反应体系的试剂：第一PCR扩增液18μl和待测DNA模板2μl，第一PCR扩增液中，Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT、甘油、Tween-20和甲酰胺含量分别为0.25U/μl、10mM、0.05mM、0.05mM、30％V/V、0.1％V/V、0.5％V/V，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物浓度为10μM，dNTPs 2.5mM。

所述实时荧光PCR的反应条件为：95℃30sec循环一次；之后40个循环，每个循环为95℃5sec，60℃30sec；每个循环的第二步收集荧光信号。