[发明专利]脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物及其制备方法

说明书

本发明涉及一种脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物，源自脂肪链‑马来酰亚胺定点修饰人粒细胞集落刺激因子游离的半胱氨酸残基，其制备方法包括脂肪链‑马来酰亚胺的合成、脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物合成、产物分离纯化和表征。与未修饰的人粒细胞集落刺激因子相比，脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物具有高的体外活性保留率，在试验动物体内持续作用时间延长，减少了给药频率，提高了药物生物利用度和疗效。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种脂肪链修饰的人粒细胞集落刺激因子衍生物及其制备方法。

背景技术

中性粒细胞是血液中主要的白细胞，被认为是抵御细菌的第一道天然防线。由于它们在血液中循环8-12小时，在移入组织中仅需2-5天，它们需要在生物体中不断被替换，对其增殖主要受粒细胞集落刺激因子(G-CSF)控制。而化疗会引起的中性粒细胞减少症(CIN)，增加感染的风险，感染会表现为发烧，即发热性中性粒细胞减少症(FN)，因此增加了可能出现严重后果的可能性。而FN和严重或长期的CIN会导致化疗延迟或中断，会影响患者的最佳治疗。

目前研究发现G-CSF可以通过与粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)结合，促进粒系细胞的增殖、分化与迁移，增强成熟粒细胞的功能。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)是由175个氨基酸组成的非糖基化蛋白,具有一个游离的半胱氨酸残基Cys 18，分子量为18.8kDa。与天然G-CSF的氨基酸序列相比，N末端多出一个甲硫氨酸。rhG-CSF在治疗与癌症化疗相关的骨髓抑制方面取得了成功，已批准用于下列临床适应症：接受骨髓抑制化疗的癌症患者；接受诱导或固化化疗的急性髓系白血病患者；接受骨髓移植(BMT)的癌症患者；接受外周血祖细胞收集和治疗的患者；严重慢性中性粒细胞减少患者。一些研究者还发现rhG-CSF在缺血性脑梗死、调节免疫、鼻咽癌放射治疗引发的急性口腔粘膜炎等方面有一些良好的作用。rhG-CSF还被应用于所有受到大量辐射照射导致造血急性辐射综合症(ARS)的患者。

目前主要有三种短效的rhG-CSF供临床使用，即非糖基化甲硫氨酰基重组人G-CSF(r-Met Hu G-CSF)如非格司亭(Filgrastim)、糖基化G-CSF如来格司亭(Lenograstim)、G-CSF的突变基因产物如那托司亭(Nartograstim)。在临床上用于癌症患者的中性粒细胞减少症都有着不错的效果，但作为一种蛋白药物，rhG-CSF在体内迅速降解或被肾脏清除，导致血浆半衰期短需要反复频繁给药，这不仅增加了患者的痛苦，而且重复注射也极易引发一些不良反应。因此，非常有必要利用长效化技术对rhG-CSF进行二次开发来改善其体内用药效果。

脂肪链修饰技术是近年来发展的一种新型的蛋白药物长效化技术。与目前常见的长效化技术，特别是PEG相比，脂肪链修饰具有以下的优势：(1)脂肪链修饰可遮蔽蛋白质多肽分子易受酶进攻的区域，从而延缓或抑制蛋白水解酶的破坏作用，延长体内作用时间；另外，脂肪链修饰主要通过与人血清白蛋白(HSA)结合改善药物的半衰期。由于脂肪酸是血浆HSA与天然的配体，可与HSA可逆结合，由于HSA的分子量大以及它可以与Fc受体(FcRn)结合，当脂肪链修饰药物与HSA结合时，限制蛋白酶进入药物，大大减少肾清除，并利用FcRn介导的循环，从而延长药物半衰期。有研究表明增加脂肪链修饰药物的脂肪链长度通常会导致更紧密的HSA结合和增加治疗半衰期。某些情况下，脂肪链修饰还能诱导药物自组装形成多聚体，进一步延长其在体内的半衰期；(2)脂肪酸是构成人体脂肪、类脂和细胞膜磷脂的重要成分，一方面不容易产生免疫原性，另一方面有助于提高亲水性药物的脂溶性，增大肠道黏膜透过性，因此脂肪链修饰更有助于提高药物的脂溶性、肠道黏膜透过性及吸收效率，有可能实现口服、外用和肺部给药。如脂肪链修饰的GLP-1药物——索马鲁肽，其口服制剂已经由FDA获批上市；(3)有研究证明脂肪链修饰可以干扰T细胞的活化，因为它能减少与MHC II分子结合，降低了免疫原性。目前已有地特胰岛素、德谷胰岛素、利拉鲁肽和索玛鲁肽等几种脂肪酸修饰药物上市，2020年全球销售总额达到100亿美元，市场前景广阔。目前还未见脂肪链修饰hG-CSF的报道。

发明内容