[发明专利]一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡及其制备方法

权利要求书

1.一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡的制备方法，其特征在于，具体操作如下：将血小板原料经过温和的物理挤出方式纳米化处理，并制成制剂；所述温和的物理挤出方式为超声整粒后20-30℃恒温下纳米级别孔径挤出；

所述血小板原料为机采PRP成品、梯度分次离心的浓缩血小板或密度梯度离心的浓缩血小板；

所述挤出方式为人力手工注射器挤出、微量泵定速注射器挤出或微流控芯片挤出；

所述制剂类型为血小板纳米囊泡悬液、复合血小板纳米囊泡凝胶、细胞复合血小板纳米囊泡悬液或生物材料表面包被血小板纳米囊泡；

所述纳米级别孔径为滤过孔径100-500纳米的MCE膜、PVDF膜、PES膜或输出通道内径100-500nm的微流控芯片；

所述梯度分次离心的浓缩血小板进行100纳米孔径的PES膜人力手工挤出NEP悬液，具体步骤如下：

（1）将含抗凝剂静脉血混匀后，置于50mL离心管，200g，10min离心；

（2）取上层血小板层，移至新离心管，再次200g，10min离心；

（3）取下层富集层，置于新离心管；

（4）2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度20℃；

（5）恒温模块加热下在20℃条件下，经100纳米孔径的PES膜进行人力手工恒速挤出，挤出速度为0.1-1.0mL/s，无菌堵头封闭封口；

（6）将获得的NEP悬液装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃暂时保存或在悬液中加入冻存液后-80℃长期保存；所述冻存液为10% DMSO+90% FBS；

所述机采PRP成品进行200纳米孔径的PVDF膜微量泵定速注射器挤出NEP凝胶制剂，具体步骤如下：

（1）将机采PRP成品混匀后，置于50mL离心管，200g，10min离心；

（2）取下层富集层，置于新离心管；

（3）2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度25℃；

（4）恒温模块加热下在25℃条件下，经200纳米孔径的PVDF膜进行微量泵定速注射器挤出，挤出速度为0.1-1.0mL/s，无菌堵头封闭封口；

（5）将NEP加入1-10%氯化钙溶液，混匀后静置1-10min，凝固为凝胶；

（6）将获得的NEP凝胶装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃保存；

所述密度梯度离心的浓缩血小板进行500纳米孔径的微流控芯片挤出NEP并包被于支架，具体步骤如下：

（1）将含抗凝剂静脉血混匀后，10mL置于50mL离心管内的20mL的75% Percoll液上，400g，30min离心；

（2）取血小板层，移至新离心管，再次200g，10min离心；

（3）取下层富集层，置于新离心管；

（4）2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度30℃；

（5）恒温模块加热下在30℃条件下，微流控芯片挤出，输出通道内径500nm，流速0.1-1.0mL/s，无菌堵头封闭封口；

（6）将NEP与3D打印的ECM/GelMA支架20-24℃共孵育24h；所述ECM/GelMA支架的制备方法如下：2% ECM、10% GelMA及0.25% LAP，混合后3D光固化打印，光固化参数：405nm，10-30W，20-40s；

（7）将被NEP包被的支架装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃保存；

所述梯度分次离心的浓缩血小板进行100纳米孔径的PES膜人力手工挤出NEP复合中性粒细胞悬液，具体步骤如下：

（1）将含抗凝剂静脉血混匀后，置于50mL离心管，200g，10min离心；

（2）取上层血小板层，移至新离心管，再次200g，10min离心；

（3）取下层富集层，置于新离心管；

（4）2号变幅杆，开2s，关3s，超声10min，控制温度20℃；

（5）恒温模块加热下在20℃条件下，经100纳米孔径的PES膜进行人力手工恒速挤出，挤出速度为0.1-1.0mL/s；

（6）将NEP与中性粒细胞按10：1数量比进行微重力培养2h，离心后调节细胞浓度至10⁴-10⁶/mL；

（7）将获得的NEP复合中性粒细胞悬液装入双层无菌纸塑袋，并贴信息标签，4℃暂时保存或在悬液中加入冻存液后-80℃长期保存；所述冻存液为10% DMSO+90% FBS。