[发明专利]一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶及克隆表达

说明书

本发明涉及涉及生物技术和分子生物学领域，更具体地，涉及一种α‑半乳糖苷酶及克隆表达方法。该方法包括利用解淀粉乳杆菌L6获取α‑半乳糖苷酶基因；将所述α‑半乳糖苷酶基因及表达载体进行酶切、连接以及转化；将所述转化后的重组质粒进行筛选；利用诱导剂将所述筛选后的重组质粒进行诱导表达。本申请首次对来自解淀粉乳杆菌的α‑Gal在大肠杆菌BL21中进行克隆表达，通过亲和层析的方法可以大量制备比较纯的酶液，具有较强的水解α‑半乳糖苷键的活性。

技术领域

本发明涉及生物技术和分子生物学领域，更具体地，涉及一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶及克隆表达。

背景技术

α-半乳糖苷酶(α-GLA)属于外切糖苷酶，能够专一的水解不同化合物分子非还原端的α-半乳糖苷键，该酶存在于各种生物体内如细菌、真菌、植物、动物当中。该酶在食品、饲料、造纸、医药等行业具有广泛的应用价值，可以去除豆粕、豆制品中的胀气因子，缓解胀气反应，水解甘露糖主链上的α-半乳糖，提高凝胶能力进而改善纸浆的品质，水解神经酰胺三己糖苷末端的α-半乳糖基治疗法布里病，还可以用于血型的转换等。

但是现有技术中，半乳糖苷酶基因的来源还比较单一，鲜有介绍来自于解淀粉乳杆菌L6的半乳糖苷酶基因在大肠杆菌BL21中进行克隆表达的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种α-半乳糖苷酶及克隆表达方法。

一方面，提供一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的克隆表达，

利用解淀粉乳杆菌L6获取α-半乳糖苷酶基因；

将所述α-半乳糖苷酶基因及表达载体进行酶切、连接以及转化；

将所述转化后的重组质粒进行筛选；

利用诱导剂将所述筛选后的重组质粒进行诱导表达。

所述的解淀粉乳杆菌L6为中国专利CN201410277246.3中所记载的解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)L6。

进一步地，所述利用解淀粉乳杆菌获取α-半乳糖苷酶基因包括：

提取解淀粉乳杆菌L6中的α-半乳糖苷酶基因组DNA；

以所述α-半乳糖苷酶基因组DNA为模板，以GLA-F和GLA-R作为引物，利用PCR扩增α-半乳糖苷酶DNA序列。

进一步地，所述利用PCR扩增α-半乳糖苷酶DNA序列的反应程序包括：

98℃预变性30s；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，扩增30个循环，72℃总延伸10min。

进一步地，所述连接中所述表达载体与所述α-半乳糖苷酶DNA的摩尔比为1.0:6.5。

进一步地，所述诱导α-半乳糖苷酶基因的表达后还包括：分离及纯化所述α-半乳糖苷酶；所述纯化方法为亲和层析。

另一方面，本发明提供一种具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

再一方面，本申请提供一种由上述的方法制备的α-半乳糖苷酶。

进一步地，所述α-半乳糖苷酶的最佳反应温度为37℃，最佳反应pH为 5.0。

进一步地，铜离子及锌离子对所述α-半乳糖苷酶具有抑制作用。

进一步地，所述α-半乳糖苷酶具有转糖基活性并合成低聚糖的能力。

进一步地，所述α-半乳糖苷酶能够利用蜜二糖合成低聚三糖、四糖及五糖。

本发明的α-半乳糖苷酶及其克隆表达方法具有以下优点：