[发明专利]一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型及其构建与应用

说明书

本发明公开一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型，所述高通量筛选细胞模型的构建方法为：(1)pGF‑promoter载体构建：将猪PCNA基因启动子克隆至pGF‑mCMV‑EF1‑Neo慢病毒载体中，获得pGF‑promoter载体；(2)转染HEK‑293T细胞：将pGF‑promoter载体和pMD2.g、psPAX2共转染HEK‑293T细胞，孵育，收集慢病毒上清液；(3)感染pTr细胞：用慢病毒感染pTr细胞；(4)G418筛选稳转株：用G418筛选培养基培养pTr细胞，最终获得pTr‑PCNA promoter‑Luciferase稳转细胞株，其命名为pTr‑luc。本发明所建立的营养物质调节猪早期胚胎发育的细胞模型可用于调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选，对于快速筛选促进猪早期胚胎发育的营养物质具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型及其构建与应用。

背景技术

提高母猪繁殖性能是提高猪场生产效率和经济效益的关键。窝产活仔数是衡量母猪繁殖性能的主要指标，胚胎死亡率则是决定窝产活仔数的关键。猪的胚胎死亡率约为30％～50％，其中很大一部分发生在妊娠早期。早期胚胎损失的原因主要是胚胎附植失败，母猪妊娠早期特别是胚胎附植期的胚胎损失最高可占到整个妊娠期胚胎或胎儿死亡率的75％。因此，提高胚胎质量，保证早期胚胎发育，降低附植失败几率从而降低早期胚胎损失对于提高母猪繁殖性能和潜力具有重要意义。

越来越多的证据表明母体营养情况的改变会影响猪胚胎质量和早期胚胎发育。目前在这方面研究做多的是日粮营养水平和氨基酸。营养素如糖类、脂肪和氨基酸等可以调节能量供应，进行表观遗传修饰，调节线粒体功能和氧化平衡状态来影响卵母细胞的发育、成熟，提高早期胚胎发育水平。胚胎滋养层细胞(Porcine trophectoderm cells，pTr)最初是从妊娠第12天收集的猪囊胚中分离出来的，常用于猪滋养外胚层的功能研究。滋养层细胞增殖分化是早期胚胎发育中重要的一环，可以将其作为细胞模型进行营养物质促进早期胚胎发育的相关研究。增殖细胞核抗原(PCNA)，分子量是36KDa，是真核生物复制复合体的核心成分。因为PCNA与细胞的合成密切相关，在细胞增殖的启动上起着重要作用，所以通常认为PCNA基因的表达情况可以在很大程度上反应细胞的增殖状态。

本发明针对母猪早期胚胎发育此关键时期，构建高通量细胞模型以筛选出某些对于早期胚胎发育有积极作用的营养物质，进而为通过营养手段调节妊娠母猪营养状况，促进早期胚胎发育，提高胚胎质量，减少早期胚胎损失提供理论依据。

发明内容

本发明公开一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型，将嵌合后荧光素酶报告基因与PCNA基因启动子通过慢病毒转导至pTr细胞，经过筛选培养后得到可以稳定传代的pTr-luc细胞系，该细胞系可用于营养物质促进pTr细胞增殖的高通量筛选。

本发明公开一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型，所述高通量筛选细胞模型的构建方法为：

(1)pGF-promoter载体构建：将猪PCNA基因启动子克隆至pGF-mCMV-EF1-Neo慢病毒载体中，获得pGF-promoter载体；

(2)转染HEK-293T细胞：将pGF-promoter载体和pMD2.g、psPAX2共转染HEK-293T细胞，孵育，收集慢病毒上清液；

(3)感染pTr细胞：用慢病毒感染pTr细胞；

(4)G418筛选稳转株：用G418筛选培养基培养pTr细胞，最终获得pTr-PCNApromoter-Luciferase稳转细胞株，其命名为pTr-luc。

所述步骤(1)中，所述猪PCNA基因启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。