[发明专利]一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法

说明书

本发明公开了一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法。该方法基于研究确定的滋养层细胞表面或胞内表达的特异性抗原及组合，并利用设计的微流控分选芯片或流式细胞仪，对胎盘滋养层样本的细胞悬浮液进行细胞分选，获得分离纯化的胎盘滋养层细胞。本发明与传统方法相比，具有无创获取标本和特异性好的优势，而且该方法取材时间较早，导致感染及流产的风险低，能实现同时对多个抗原进行同步标记和特征荧光信号的识别和分选，准确性得到较大提升，检测结果又具有更高的可信度和更广的覆盖范围。

技术领域

本发明属于细胞分离技术领域。更具体地，涉及一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离筛选滋养层细胞的方法。

背景技术

孕前、产前和新生儿三级防控体系是我国降低出生缺陷、提高人口素质的重要手段之一，其中产前筛查和诊断是最为复杂且难度最高的环节。

目前临床上用于产前诊断的羊膜腔穿刺术或者脐静脉穿刺术，以及胎儿游离核酸测序等无创产前筛查技术都存在各种不足；羊膜腔穿刺术或者脐静脉穿刺术取材方法操作感染和流产的风险高、分析时间长，检测项目和范围有限，而且诊断时间限制在孕中晚期，孕妇的接受度低且不利于临床处理。胎儿游离核酸测序技术检验范围极其有限，且存在仅可检测3-5条指定染色体倍性，假阳性、假阴性情况难以避免，对常见变异检出能力不足，母血胎儿游离核酸的含量也存在个体差异性等问题。

申请人的专利申请CN111304153A披露了一种分离滋养层细胞的方法，该方法通过确定滋养层细胞表面表达的特异性抗原，利用带有对应特异性抗体的免疫磁珠技术，从胎盘滋养层样本细胞悬浮液中分离纯化胎盘滋养层细胞。该技术与传统的羊膜腔穿刺和绒毛穿刺相比，具有无创的优势，且取材时间较早，感染及流产的风险低，检测结果又具有相似的可信度。另一方面看，该技术仍有改进的空间，所披露适用的抗体组合有限，准确性和特异性扔有待更好的提升。申请人团队对该项目一直在进行持续的研究开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于流式细胞分离或微流控技术从孕妇宫颈脱落细胞中分离筛选滋养层细胞的方法，不仅克服传统方法的问题和缺陷，还可实现同时对更多多个抗原进行同步标记和特征荧光信号的识别和分选，准确性得到较大提升，同时特异性也优于之前的免疫磁珠法分离方案。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种分离滋养层细胞的方法，包括如下步骤：

(1)将宫颈脱落细胞液样本制备成样本细胞悬浮液；

(2)向样本细胞悬浮液中加入特异性抗体进行孵育；

所述特异性抗体是对应滋养层细胞表面或胞内表达的特异性抗原的抗体组合；优选地特异性抗体组合为HLA-G+CK7、HLA-G+CK18、HLA-G+β-HCG、CD31+HPL、MMP9+CD31、HLA-G+HPL、HLA-G+MMP9、HLA-G+CD31、HLA-G+P、CD31+P、HLA-G+CDH5、CD31+CDH5、CD31+CK7+HLA-G、HLA-G+CK18+CD31、HLA-G+β-HCG+CD31、CD31+HPL+HLA-G、MMP9+CD31+HLA-G、CD31+P+HLA-G或HLA-G+CDH5+CD31的组合；

(3)利用流式细胞仪将步骤(2)孵育完成的细胞重悬液进行分选，即可获得分离纯化的胎盘滋养层细胞；

或利用微流控分选芯片，将步骤(2)孵育完成的细胞重悬液进行荧光标记微流控细胞分选，即可获得分离纯化的胎盘滋养层细胞。

优选地，步骤（3）所用微流控分选芯片的结构为：包括基片和与之贴合的盖片；选用包括但不限于亚克力作为基本材质通过注塑成型技术制成；

所述基片的一面上设有主流道、侧流道A和侧流道B，两个侧流道分别对应靠近主流道的左、右两端部；