[发明专利]口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测体系和方法的建立

权利要求书

1.口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测体系，其特征在于，反应总体系为20μL，包括RT-LAMP缓冲液15.2μL，BstAMV酶混合液1.5μL，外引物F3和B3各0.04μL(100μM)，内引物FIP和BIP各0.5μL(100μM)，环引物Floop和Bloop各0.11μL(100μM)，中性红1μL(500μM)，模板1μL；反应时间55min、反应温度65℃；反应结束后，若反应管溶液变为粉红色判为阳性，若为橘黄色则判为阴性。

2.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测体系，其特征在于，六条引物如下：

3.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测体系，其特征在于，六条引物如下：

4.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测体系，其特征在于，六条引物如下：

5.口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)口蹄疫病毒目的基因3D片段的筛选、合成与鉴定

对GenBank中下载的FMDV 3D序列进行血清型分类以及相似性分析，根据时间就近性、血清型和同血清型序列之间的差异性为原则，选择了39条3D 3′端500bp区域序列并在序列的5′端加上T7启动子序列(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)送去广州艾基生物技术有限公司以Amp+的pUC57为载体进行合成；对合成的3D-T7 pUC57设计引物扩增3D和T7合成区域和扩增的PCR产物送去测序以鉴定序列合成的正确性；

(2)FMDV可视化RT-LAMP检测方法的建立及优化

制作3D RNA转录本并进行了验证，再应用RT-LAMP通用检测试剂盒对设计的多套RT-LAMP引物进行了筛选，最终得到三套扩增效果较好的引物；用其中检测效果最好的RT-LMAP引物对RT-LAMP反应体系中的引物浓度、反应时间、反应温度以及反应的显色指示剂(羟基萘酚蓝、钙黄绿素、SYBR green I、中性红、酚红和溴百里酚蓝)进行了优化和筛选，建立了FMDV反应总体系为20μL的RT-LAMP检测体系，包括RT-LAMP缓冲液15.2μL，BstAMV酶混合液1.5μL，外引物F3和B3各0.04μL(100μM)，内引物FIP和BIP各0.5μL(100μM)，环引物Floop和Bloop各0.11μL(100μM)，中性红1μL(500μM)，模板1μL；反应时间55min、反应温度65℃；反应结束后，若反应管溶液变为粉红色判为阳性，若为橘黄色则判为阴性；

(3)RT-LAMP方法的特异性、敏感性检测及临床样品检测

对建立的RT-LAMP反应进行了交叉反应验证，结果表明该方法不与BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV和PCV等病毒发生交叉反应；然后分别以3D DNA和RNA的10⁷-10⁰copies/μL为模板对RT-/LAMP，RT-/QPCR和RT-/PCR进行了比较，结果为质粒为模板，可以检测到10³copies/μL，以RNA为模板RT-LAMP可以检测到10⁴copies/μL。