[发明专利]口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测体系和方法的建立

说明书

本发明公开了FMDV可视化RT‑LAMP检测方法的建立。以合成的39条3D‑T7序列的体外RNA转录本为模板，对RT‑LAMP引物、引物浓度、反应时间、反应温度和显色剂等进行了筛选。建立了FMDV的RT‑LAMP检测方法，总体系为20μL，包括RT‑LAMP缓冲液15.2μL，BstAMV酶混合液1.5μL，外引物F3和B3各0.04μL(100μM)，内引物FIP和BIP各0.5μL(100μM)，环引物Floop和Bloop各0.11μL(100μM)，中性红1μL(500μM)，模板1μL。反应时间55min，反应温度65℃。反应结束后，若反应管溶液变为粉红色判为阳性，若为橘黄色则判为阴性。该方法特异性强，不与BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV和PCV等病毒发生反应。建立的FMDV可视化RT‑LAMP方法为基层现场检测奠定了基础，以达到快速诊断FMDV的目的。

技术领域

本发明属于蹄疫病毒检测技术领域，特别涉及口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测体系和方法的建立。

技术背景

口蹄疫(Foot andMouth Disease,FMD)是一种由口蹄疫病毒(Foot andMouthDisease Virus,FMDV)感染猪、牛、羊以及许多野生偶蹄类动物而引起的高度传染水泡性疾病。成年动物感染时会出现体温持续升高，口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤生发水泡，严重时可致死；未成年动物则可能会在在水泡产生前产生一系列疾病如急性心肌炎、心肌梗死等导致提前死亡。口蹄疫虽然病死率低，但是发病率较高，不仅仅对感染动物的正常生长发育会产生严重影响，导致生产能力大幅度下降严重危害畜牧业的健康发展，而且会带来巨大的外贸易经济损失和防控经济损失。因此世界动物卫生组织将其列为动物A类烈性传染病，我国农业部也将FMD列为一类动物疾病。

口蹄疫根据血清学可分为七个血清型，七个血清学又可以根据地域同源性划分为亚欧型:O型、A型、C型、Asia1型；南非型：南非1型(SAT1)、南非2型(SAT2)、南非3型(SAT3)。根据FMDV毒株基因序列和区域进化关系分析，每个血清型又可以分为多个拓扑型(topotype)。

口蹄疫病毒诊断可以分为临床诊断和实验室诊断。临床诊断可由成年发病动物会在其唇部、舌面、齿龈、蹄踵、蹄叉和乳房等部位出现特征性地水泡现象，疼痛难忍而判定。但幼年动物常常在出现特征性水泡前死亡且死亡率较高，因此实验室的诊断也是必不可少的。

口蹄疫被定为国家一类动物疫病，在我国的诊断防控上面占据着重要的地位。因此它的各种各样的实验室诊断方式不断被科研人员丰富起来。根据各个检测方法原理的不同可以将实验室诊断方式总共分为三大类。一是病原分离技术—OIE检测病原的“黄金标准”。二是血清学检测技术—一般根据抗原抗体以及补体之间的特殊结合作用来检测病原。三是分子生物学检测技术—利用碱基的互补配对结合，设计引物，然后对病毒的基因片段扩增进行确认。

环介导等温扩增技术是一种新兴的核酸扩增方法，依靠链置换DNA聚合酶—BstDNA聚合酶特有的链置换功能和较强的热稳定性和根据靶基因的设计2对引物或者3对引物，可以在较短的时间和恒温的条件下内将极少拷贝数的DNA扩增数百万倍。这种方法最初由日本学者Notomi提出，并且于2000年首次在NucleicAcids Res杂志上公开发表。与常规的核酸诊断QPCR、PCR方法相比，不需要特定的仪器—水浴锅也可以完成反应，不需要变化的温度—恒定温度(一般在60～65℃之间)，而且在有环引物的辅助下反应时间大大缩短，只需要30-60min即可完成反应。多引物与靶区域的高符合性和针对性以及Bst DNA聚合酶的特性使得LAMP有着与qPCR相似的灵敏性和特异性，较PCR方法的灵敏性可高出10-100倍。LAMP反应结果产生的白色沉淀可以通过肉眼观察，因此这种方便、简单、快速和特异的检测方法得到了快速的发展且有着极为广泛的研究和应用前景。例如被用来多种病原微生物的检测，胚胎以及食品生物安全等方面检测。