[发明专利]一种复杂DNA的合成方法及其应用

权利要求书

1.一种复杂DNA的合成方法，其特征在于，包括：

对待合成DNA进行序列分析，确定其含有的分割序列的位置以及II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶完整识别位点信息，所述分割序列为缺少第一II型限制性内切酶完整识别序列的5’或3’末端1-2个碱基的序列，

根据序列分析结果，选择拟使用的第一II型限制性内切酶、第二II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶，其中，第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶为不同的II型限制性内切酶，

所述待合成DNA的序列中不含有所选择的第一II型限制性内切酶、第二II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶的完整识别序列，

在选择的第一II型限制性内切酶对应的分割序列的最后一个碱基之后将待合成DNA分割为n个序列片段，依次记为A1、A2、A3至An，n＞1且为整数，

在序列片段A₁的3’末端添加碱基以使其沿5’至3’方向依次形成所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列，所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列之间间隔6个任意碱基，在序列片段An的5’ 末端沿5’至3’方向依次添加所述IIS型限制性内切酶的完整识别位点以及与所述第一II型限制性内切酶经酶切后形成粘性末端配对的碱基、3’末端添加所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列，在序列片段A₂-A_n-1的5’末端沿5’至3’方向依次添加所述IIS型限制性内切酶的完整识别位点以及与所述第一II型限制性内切酶经酶切后形成粘性末端配对的碱基、3’末端添加碱基以使其沿5’至3’方向依次形成所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列，所述第一II型限制性内切酶和所述第二II型限制性内切酶的完整识别序列之间间隔6个任意碱基，

分别合成添加碱基后的所述序列片段，除序列片段A₁外，依次将相邻的两个序列片段分为一组，在每组中，利用所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠前的序列片段，利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠后的序列片段，将各组经酶切的两个序列片段连接后，再依次对得到的连接片段进行编号，将相邻的两个连接片段分为一组，在每组中，利用所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠前的片段，利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切排序靠后的片段，将各组经酶切的两个片段连接后，重复上述步骤，直至获得除序列片段A₁外的所有序列片段的连接产物，

将除序列片段A₁外的所有序列片段的连接产物利用所选择的IIS型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切后与经所选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶双酶切的序列片段A₁连接，得到待合成DNA；

其中，所述第一II型限制性内切酶为切割后产生5’端突出的4个碱基粘性末端的II型限制性内切酶。

2.根据权利要求1所述的复杂DNA的合成方法，其特征在于，所述第一II型限制性内切酶为选自AflII、AgeI、BamHI、BssHII、BglII、EcoRI、HindIII、MluI、NcoI、SpeI、SalI、XbaI、XhoI、NotI、AscI中的一种或多种。