[发明专利]一种复杂DNA的合成方法及其应用

说明书

本发明涉及DNA合成技术领域，具体涉及一种复杂DNA的合成方法及其应用。本发明提供的复杂DNA的合成方法包括：分析待合成DNA，确定其含有的分割序列的位置以及II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶完整识别位点信息，选择拟使用的II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶，在分割序列的最后一个碱基之后将待合成DNA分割为多个序列片段，在每个序列片段的末端添加碱基，使其能够被II型限制性内切酶、IIS型限制性内切酶酶切且形成配对的粘性末端，分别合成各序列片段，利用II型限制性内切酶酶切、IIS型限制性内切酶酶切后，连接酶切产物。该方法为复杂DNA序列的合成提供了简便、快速、高效的方法。

技术领域

本发明涉及DNA合成技术领域，具体涉及一种复杂DNA的合成方法及其应用。

背景技术

随着基因工程和合成生物学的发展和广泛应用，DNA合成技术已成为农业、食品、医药、材料等领域普遍使用的技术。目前，基因合成的方法主要包括连接酶法和PCR法，现有的PCR法和连接酶法主要适用于常规DNA序列的合成，对于存在大量重复序列、GC含量较高或较低、存在复杂二级结构的序列的合成效率和准确性均较差。然而，在进行生物体的基因修饰、全基因合成等操作时，上述复杂DNA的合成也经常涉及。因此，开发能够适用于复杂DNA合成的方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种复杂DNA的合成方法及其应用，该方法能够弥补传统PCR法和连接酶法的不足，用于存在大量重复序列、GC含量较高或较低、存在复杂二级结构等复杂DNA的合成。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种复杂DNA的合成方法，该方法包括：

对待合成DNA进行序列分析，确定其含有的分割序列的位置以及II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶完整识别位点信息，所述分割序列为在第一II型限制性内切酶完整识别序列中缺少其切割后所形成粘性末端一侧的碱基所得到的序列，

根据序列分析结果，选择拟使用的第一II型限制性内切酶、第二II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶，其中，第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶为不同的II型限制性内切酶，

所述待合成DNA的序列中不含有所选择的第一II型限制性内切酶、、第二II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶的完整识别序列，

在选择的第一II型限制性内切酶对应的分割序列的最后一个碱基之后将待合成DNA分割为n个序列片段，依次记为A1、A2、A3至An，n＞1且为整数，

在序列片段A₁的3’末端添加碱基，以使其能够被选择的第一II型限制性内切酶第二II型限制性内切酶酶切，在序列片段An的5’末端添加碱基以使其能够被选择的IIS型限制性内切酶酶切、且酶切后形成第一II型限制性内切酶对应的粘性末端、3’末端添加第二II型限制性内切酶的完整识别序列，在序列片段A₂-A_n-1的5’末端添加碱基以使其能够被选择的IIS型限制性内切酶酶切、且酶切后形成第一II型限制性内切酶对应的粘性末端、3’末端添加碱基以使其能够被选择的第一II型限制性内切酶和第二II型限制性内切酶酶切，

分别合成添加碱基后的所述序列片段，利用所述序列片段经添加碱基所形成的限制性内切酶完整识别序列对应的限制性内切酶进行酶切后，连接各酶切产物。

本发明通过将待合成序列分成更短的序列片段，在序列片段的末端引入原始序列中不存在的II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶的识别位点，利用II型限制性内切酶和IIS型限制性内切酶的配合作用，将各序列片段连接得到待合成DNA。对于含有较多重复序列、GC含量较高或较低、含有复杂二级结构的复杂DNA序列，利用上述方法能够显著提高DNA合成的效率和准确性。