[发明专利]融合蛋白及其靶向PSCA的CAR及其应用

说明书

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种融合蛋白及其靶向PSCA的CAR及其应用。所述融合蛋白为SIRPγ融合蛋白，包含胞外段、跨膜结构和胞内信号区。该融合蛋白和靶向PSCA的CAR结构连接共同或单独转染免疫细胞,该免疫细胞在缺氧环境下活性增强，而且以逆转肿瘤微环境，破除肿瘤组织中抑制性信号对CAR‑T功能的影响，实现了CAR‑T治疗有效性，同时能够保证一定的安全性。

技术领域

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种融合蛋白及其靶向PSCA的CAR及其应用。

背景技术

CAR-T全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)是模拟TCR功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域依次连接组成，胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1BB，CD28，ICOS(CD278)。CAR分子包含的ScFv对肿瘤抗原具有特异性识别的特点，通过铰链区和跨膜区进行T细胞激活细胞传递。目前临床上CAR-T治疗主要运用于血液瘤系统的肿瘤治疗。

CD47作为继PD-1/PD-L1,CTLA-4之后新的免疫检查点，通过向巨噬细胞传递“不要吃我”信号，抑制固有免疫的进行。目前有文献报道采用靶向CD47 ScFv制备CAR-T进行肿瘤治疗。CD47可以促成肿瘤逃逸的免疫微环境，不过由于肿瘤的异质性，单独靶向CD47疗效有限，并且外源的ScFv由于其强的亲和力可能会导致CAR-T细胞过度活化存续性差和非特异性引起安全隐患。因此，采用更安全有效的方案去识别CD47破除肿瘤微环境的逃逸信号十分重要。信号调节蛋白α(SIRPα)是CD47的配体之一，可与CD47结合，抑制巨噬细胞的吞噬作用，目前绝大多数关于CD47的研究均集中于SIRPα。SIRPγ也可与CD47结合，其存在于T细胞表面，胞外区由一个V结构域和两个C1结构域组成，无胞内信号，仅通过CD47传递单向信号，目前很少有研究者针对SIRPγ进行改造，而我们认为其是更适合进行针对CD47进行肿瘤微环境破除的配体。因此，我们选择SIRPγ蛋白的胞外段进行改造设计，并进一步设计肿瘤免疫抑制抵抗型的CAR，并且CD47作为继PD-1/PD-L1,CTLA-4之后新的免疫检查点，通过向巨噬细胞传递“不要吃我”信号，抑制固有免疫的进行。目前有文献报道采用靶向CD47ScFv制备CAR-T进行肿瘤治疗。CD47可以促成肿瘤逃逸的免疫微环境，不过由于肿瘤的异质性，单独靶向CD47疗效有限，并且外源的ScFv由于其强的亲和力可能会导致CAR-T细胞过度活化存续性差和非特异性引起安全隐患。因此，采用更安全有效的方案去识别CD47破除肿瘤微环境的逃逸信号十分重要。

前列腺干细胞抗原(PSCA)是最早发现于前列腺癌的GPI锚定的细胞膜蛋白,PSCA在前列腺癌,胰腺癌,膀胱癌等肿瘤中表达增加,相反在食管癌和胃癌中表达降低可能在胃上皮中发挥肿瘤抑制功能,PSCA发挥致瘤和抑瘤两种截然不同的作用与细胞所处的环境不同有关。除此之外,PSCA作为肿瘤的免疫治疗的靶点也显示出其良好的临床应用潜力。因此PSCA不仅成为肿瘤诊断和预后判断的生物学标记也是肿瘤免疫治疗重要的候选靶蛋白。

发明内容

有鉴于此，本发明在于提供一种逆转肿瘤微环境的融合蛋白，其与靶向PSCA的CAR结构a构成一种含有该融合蛋白的免疫细胞，该免疫细胞可以靶向杀伤CD47阳性的的肿瘤细胞；破除肿瘤组织中抑制性信号对免疫细胞功能的影响，实现了CAR-T治疗有效性，同时能够保证一定的安全性，其中含有融合蛋白的免疫细胞与不含有融合蛋白的免疫细胞相比较，含有融合蛋白的免疫细胞的体内存续时间会更长并且安全性更高。。

进一步，所述融合蛋白为SIRPγ融合蛋白，所述SIRPγ融合蛋白结构包含胞外段、跨膜结构和胞内信号区，所述SIRPγ胞外段氨基酸序列如SEQ ID NO:5或其功能性变体所示；优选地，所述跨膜结构来源于人CD28跨膜区或人CD8来源跨膜区；优选地，所述跨膜结构氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或其功能性变体；或如SEQ ID NO:4所示或其功能性变体。