[发明专利]靶向CEA的缺氧诱导启动的CAR结构及免疫细胞和应用

权利要求书

1.靶向CEA的缺氧诱导启动的CAR结构，其特征在于，所述CAR结构包含缺氧可调控启动子和CAR结构a；所述缺氧可调控启动子的核酸序列包含如SEQ ID NO：1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的CAR结构，其特征在于，所述CAR结构a包括CEA单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD137和CD3ξ双刺激信号；优选地，所述CAR结构a氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示或其功能性变体；更优选的，所述CAR结构a核苷酸序列包括如SEQ ID NO：12和SEQID NO：13所示的序列。

3.一种包含权利要求1或2任意一项所述的CAR结构的CAR1，其特征在于，所述CAR1还包括逆转肿瘤微环境的融合蛋白，所述融合蛋白为SIRPγ融合蛋白，所述SIRPγ融合蛋白结构包含胞外段、跨膜结构和胞内信号区。

4.根据权利要求3所述的CAR1，其特征在于，所述跨膜结构来源于人CD28跨膜区或人CD8来源跨膜区；优选地，所述跨膜结构氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或其功能性变体；或如SEQ ID NO:4所示或其功能性变体。

5.根据权利要求3或4所述的CAR1，其特征在于，所述SIRPγ胞外段氨基酸序列如SEQID NO:5所示或其功能性变体。

6.根据权利要求3所述的CAR1，其特征在于，所述SIRPγ融合蛋白的结构为SIRPγ-CD28TM-CD28或SIRPγ-CD8TM-4-1BB；优选地，所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD28TM-CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示或其功能性变体；或所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD8TM-4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示或其功能性变体。

7.根据权利要求6所述的CAR1，其特征在于，编码所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD28TM-CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；或编码所述SIRPγ融合蛋白SIRPγ-CD8TM-4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

8.核酸序列，其特征在于，编码权利要求1-2任一项所述的CAR结构，其包含如SEQ IDNO：10所示的序列。

9.核酸序列，其特征在于，编码权利要求3-7任一所述的CAR1，其包含如SEQ ID NO：11所示的序列。

10.包含权利要求8或9所述核酸序列的重组质粒，其特征在于，所述质粒还包括表达载体，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体中的任一种。

11.一种包含权利要求1或2所述的CAR结构的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞还包括逆转肿瘤微环境的融合蛋白，所述融合蛋白为SIRPγ融合蛋白，所述SIRPγ融合蛋白结构包含胞外段、跨膜结构和胞内信号区；优选地，所述细胞是T细胞、T细胞前体或者NK细胞。

12.一种制备如权利要求11所述的免疫细胞的方法，其特征在于：将权利要求1或2所述CAR结构和所述融合蛋白共同表达于一个载体转染免疫细胞或者将权利要求1或2所述CAR结构和所述融合蛋白分别表达于两个载体转染免疫细胞。

13.一种提高缺氧环境下CAR-T细胞杀伤能力的方法，其特征在于，构建一种包含权利要求1-2任一所述的CAR结构的重组质粒并感染T淋巴细胞，然后作用于靶细胞。

14.权利要求1或2所述的CAR结构或权利要求11所述的免疫细胞或权利要求8或9所述的核酸序列或权利要求10所述的重组质粒或权利要求3-8任一所述的CAR1在制备肿瘤药物中的应用。