[发明专利]靶向CEA的缺氧诱导启动的CAR结构及免疫细胞和应用

说明书

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，本发明属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向CEA的缺氧诱导启动的CAR结构及免疫细胞和应用。所述CAR结构包含缺氧可调控启动子和CAR结构a。所述免疫细胞中还包括逆转肿瘤微环境的融合蛋白，所述融合蛋白为SIRPγ融合蛋白，所述SIRPγ融合蛋白结构包含胞外段、跨膜区和胞内信号区。该CAR结构转染的CAR‑T细胞在缺氧环境下活性增强，而且包含SIRPγ融合蛋白的CAR‑T细胞可以逆转肿瘤微环境，破除肿瘤组织中抑制性信号对CAR‑T功能的影响，实现了CAR‑T治疗有效性，同时能够保证一定的安全性。

技术领域

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向CEA的缺氧诱导启动的CAR结构及免疫细胞和应用。

背景技术

CAR-T全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)是模拟TCR功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域依次连接组成，胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1BB，CD28，ICOS(CD278)。CAR分子包含的ScFv对肿瘤抗原具有特异性识别的特点，通过铰链区和跨膜区进行T细胞激活细胞传递。目前临床上CAR-T治疗主要运用于血液瘤系统的肿瘤治疗。

CAR-T疗法虽然在血液系统瘤中取得较好的成绩，但CAR-T在实体瘤中的效果不如血液系统瘤，其原因一方面因为CAR-T较难进入实体瘤内部，一方面即便CAR-T细胞进入实体瘤内部也因为肿瘤微环境而不能正常发挥功能，这些都影响CAR-T细胞在实体瘤治疗的疗效；并且由于实体瘤异质程度高，实体瘤靶点往往在正常组织也有所表达，因此还存在脱靶风险等安全问题。虽然目前有构建第四代CAR、有构建双CAR(构建带有双抗原的CAR-T)或带有激活抑制功能的iCAR的结构以期望提高肿瘤CAR-T治疗的有效性和安全性，但这些CAR结构仍存在安全性或较难被激活的问题。总之CAR-T疗法目前较多研究为血液瘤治疗，实体瘤微环境较为复杂，如肿瘤微环境、肿瘤异质性等特点，使CAR-T疗法的应用受到局限，因此，构建一种在肿瘤微环境中特异启动活化的CAR结构很有必要。酸性和缺氧是肿瘤微环境中的两大物理因素，肿瘤中的大部分的细胞都处在缺氧的环境中，而缺氧改变了肿瘤细胞的糖代谢途径，产生大量的乳酸，造成肿瘤微环境中酸性的特征，而这些酸性可以降低肿瘤细胞凋亡，增强细胞的增殖和生长，并且帮助肿瘤细胞的迁移。缺氧在实体瘤微环境研究比较清楚，如果可以设计在缺氧条件下被激活的可调控启动子，就可以达到在肿瘤微环境中特异性激活下游蛋白的表达从而提高CAR-T细胞的有效性和安全性的目的。另外信号调节蛋白α(SIRPα)是CD47的配体之一，可与CD47结合，抑制巨噬细胞的吞噬作用，目前绝大多数关于CD47的研究均集中于SIRPα。SIRPγ也可与CD47结合，其存在于T细胞表面，胞外区由一个V结构域和两个C1结构域组成，无胞内信号，仅通过CD47传递单向信号，目前很少有研究者针对SIRPγ进行改造，并且CD47作为继PD-1/PD-L1,CTLA-4之后新的免疫检查点，通过向巨噬细胞传递“不要吃我”信号，抑制固有免疫的进行。目前有文献报道采用靶向CD47 ScFv制备CAR-T进行肿瘤治疗。CD47可以促成肿瘤逃逸的免疫微环境，不过由于肿瘤的异质性，单独靶向CD47疗效有限，并且外源的ScFv由于其强的亲和力可能会导致CAR-T细胞过度活化存续性差和非特异性引起安全隐患。因此，采用更安全有效的方案去识别CD47破除肿瘤微环境的逃逸信号十分重要。

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是一种糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，相对分子质量为200kDa，最初由Gold和Freedman报道，表达于上皮源性肿瘤中如结直肠癌，胃癌、肺癌、子宫内膜腺癌、卵巢癌，正常组织细胞中只有消化道细胞有少量的CEACAMs在细胞膜表达。目前广泛应用于临床辅助诊断，而该CEACAMs在生理条件下朝向胞腔内表达从而避免脱靶毒性。临床上CEACAM5阳性实体瘤治疗主要包括手术、放疗、单抗及小分子抑制剂等，但传统的方法无法做到系统性治疗，且健康细胞损害较大，CEA可作为靶向CEA的CAR-T疗法的优选靶点。

发明内容