[发明专利]一种快速筛选基因编辑猪阳性细胞系的方法

说明书

本发明涉及一种快速筛选基因编辑猪阳性细胞系的方法，属动物转基因技术领域。本发明针对已知的不同基因编辑类型的猪阳性成纤维细胞系，进行PCR、酶切及测序鉴定，基于细胞PCR条带灰度值，筛选获得细胞基因型鉴定所需的最低细胞量；将目的基因表达载体转染至猪成纤维细胞并进行单细胞培养筛选，当单克隆细胞系形成时，抠取后于培养板扩大培养并按上述最低细胞量计数进行基因型鉴定，经鉴定后立即进行体细胞核移植，取出胎儿分离培养及鉴定后获得大量转基因猪阳性成纤维细胞系。本发明克服了基因编辑猪阳性细胞系筛选周期长、效率低、成功率低的问题，对促进转基因猪的生产具有重要的意义。

技术领域

本发明属于动物转基因技术领域，具体的说，涉及一种快速筛选基因编辑猪阳性细胞系的方法。

背景技术

体细胞核移植技术从诞生至今已超过二十年的历史，是目前研究中唯一能通过猪体细胞获得具有发育全能性猪胚胎的技术，加之动物基因编辑技术的出现，体细胞核移植技术也是生产不同基因编辑猪个体的主要方法，在动物基因遗传生物学、人类疾病模型以及异种器官移植的研究中得到了广泛的应用，因此，猪体细胞核移植技术移植是生命科学界研究的热点和关注的焦点，大量基因编辑猪阳性细胞的筛选是各种基因编辑猪克隆生产的前提和基础。

目前，猪体细胞核移植多选用胎儿成纤维细胞作为核移植供体细胞，这种方法打破了猪等大动物因缺乏胚胎干细胞而无法生产转基因猪的限制。然而，体外培养的猪成纤维细胞的寿命较短，易老化，不易进行长期的传代培养，不能经受一些复杂的基因修饰和长期的筛选鉴定，而且实现基因编辑的效率也非常低、所需细胞筛选周期长、筛选过程复杂，现阶段，选择猪胎儿成纤维细胞作为核移植的供体细胞成功获得克隆猪已有大量报道。

为了获得目的基因修饰的克隆猪个体，还需在体外对猪胎儿成纤维细胞进行基因修饰并在发生大量随机基因修饰的细胞群体中把目的基因已稳定修饰的细胞筛选出来，并作为体细胞核移植的供体细胞，其方法是将大量发生目的基因随机修饰的细胞群体进行极度稀释后进行单细胞培养，获得数个基因型各异的单克隆细胞系，再对不同克隆细胞系进行基因型鉴定，筛选出目的基因稳定修饰的单克隆细胞系用作核移植的供体细胞，传统的鉴定方法需要提供大量的细胞系提取DNA做基因型鉴定，这时，会致使剩余单克隆细胞系的数量减少、细胞活力降低、细胞出现老化、细胞间的信号传递减弱而使细胞增殖减慢，甚至经过再次传代后而导致长期筛选的单克隆细胞系死亡，使细胞筛选的成功率大大降低，严重制约了转基因克隆猪的生产效率。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供了一种快速筛选基因编辑阳性细胞系的方法，本方法在已有的不同基因编辑类型猪阳性细胞系的基础上，利用显微操作系统对已知的不同基因编辑类型的猪阳性成纤维细胞系分别按不同的细胞量要求准确计数后进行PCR、酶切及测序鉴定，基于细胞PCR条带灰度值，筛选获得细胞基因型鉴定所需的最低细胞量。为验证利用所需的最低细胞量鉴定克隆点细胞系结果的可行性，将目的基因表达载体转染至猪成纤维细胞并进行单细胞培养筛选，当单克隆细胞系形成时，抠取后于96孔板培养并按上述最低细胞量计数进行基因型鉴定，经鉴定后立即进行体细胞核移植，取出胎儿分离培养及鉴定后获得大量转基因猪阳性成纤维细胞系。本发明克服了基因编辑猪阳性细胞系筛选效率低、成功率低的问题，能够在最短的时间内高效地筛选获得大量的基因编辑猪成纤维细胞系，对促进转基因猪的生产和批量克隆具有重要的意义。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

所述的快速筛选基因编辑猪阳性细胞系的方法，具体步骤为：

1）确定猪成纤维细胞基因型鉴定所需的最低细胞量

针对已知的不同基因编辑类型的猪阳性成纤维细胞系，进行PCR、酶切及测序鉴定，基于细胞PCR条带灰度值、酶切结果和测序结果，筛选获得细胞基因型鉴定所需的最低细胞量；

2）转基因阳性猪成纤维细胞系的筛选