[发明专利]一种蚌类环境DNA宏条形码引物、鉴定方法及应用

权利要求书

1.一种用于蚌类群落结构研究的环境DNA宏条形码鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：蚌类环境DNA宏条形码引物的筛选，得到引物16SPP147，其由SEQ ID NO：3所示上游引物和SEQ ID NO：4所示下游引物组成；

步骤(2)：蚌类环境DNA宏条形码数据库构建；步骤(2)所述蚌类环境DNA宏条形码数据库构建包括以下过程：在GenBank数据库上下载中国蚌类的线粒体基因组序列，包括母系和父系，若没有线粒体基因组序列的就下载16SrRNA线粒体片段，如果这两种都无，则提取该蚌的组织DNA，并进行线粒体基因组序列测序；

步骤(3)：根据蚌类群落所在水域的大小，设计采样点，采集水样；

步骤(4)：将水样进行处理后，提取其中的总环境DNA；

步骤(5)：将总环境DNA用步骤(1)筛选的引物进行PCR扩增；

所述PCR扩增的反应程序为：

95℃下预变性2min；

95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；

72℃再延伸5min；

所述PCR扩增的反应体系为：

5×FastPfu Buffer 4μl，2.5mM dNTPs 2μl，FastPfu Polymerase 0.4μl，5μM上游引物0.8μl，5μM下游引物0.8μl和DNA模板10ng，去离子水补足总体积至20μl；

步骤(6)：高通量测序，OTU聚类与注释；

步骤(7)：确定待测水域中蚌类的物种组成和群落结构；

步骤(7)所述蚌类物种组成的分析包括：去除比对到非蚌类的数据信息，筛选出比对至蚌类，且identity值≥97％，E-value≤10^-10的OTU；将比对至同一物种的OTU进行合并，若有OTU无法比对至种水平，则往上一级如属、科等进行统计。

2.根据权利要求1所述的用于蚌类群落结构研究的环境DNA宏条形码鉴定方法，其特征在于，步骤(3)所述水样采集的方法为：设置采样点，使用采水器在水下0.5-1m处采集1L水样，做3次生物学重复，水样低温保存于无菌的广口瓶。

3.根据权利要求1所述的用于蚌类群落结构研究的环境DNA宏条形码鉴定方法，其特征在于，步骤(3)所述水域为鄱阳湖水域，鄱阳湖水域选自鄱阳湖通江水道、鄱阳湖主湖区、军山湖和青岚湖中至少一处。

4.根据权利要求1所述的用于蚌类群落结构研究的环境DNA宏条形码鉴定方法，其特征在于，步骤(4)中的水样处理方法为在24小时内用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤，每次过滤前后，均对过滤器材进行消毒处理，避免交叉污染，且每次过滤设置1个阴性对照。

5.根据权利要求1所述的用于蚌类群落结构研究的环境DNA宏条形码鉴定方法，其特征在于，步骤(6)所述高通量测序，OUT聚类与注释包括：

对原始数据的质量进行质控过滤，包括去除嵌合体，筛除拼接序列的overlap区允许的错配比率0.2的序列，按照100％相似性对非重复序列进行OTU聚类；将OTU代表序列与步骤(2)构建的蚌类环境DNA宏条形码数据库进行比对、分类注释，并得到相应的OTU丰度表。

6.权利要求1-5任一项所述的用于蚌类群落结构研究的环境DNA宏条形码鉴定方法在蚌类生物多样性研究中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蚌类生物多样性研究为蚌类物种组成研究。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蚌类生物多样性研究为蚌类雄性物种鉴定研究。