[发明专利]一种蚌类环境DNA宏条形码引物、鉴定方法及应用

说明书

本发明具体涉及一种蚌类环境DNA宏条形码引物、鉴定方法及应用，属于分子生态学领域。本发明公开一种蚌类环境DNA宏条形码引物，所述引物的名称为16SPP300或者16SPP147；其中，引物16SPP300由SEQ ID NO：1所示上游引物和SEQ ID NO：2所示下游引物组成；引物16SPP147由SEQ ID NO：3所示上游引物和SEQ ID NO：4所示下游引物组成。本发明还公开一种用于蚌类群落结构研究的环境DNA宏条形码鉴定方法和应用。本发明方法可补充传统调查方法中难采到、濒危的蚌类动物丰度数据，且能鉴定雄性蚌类物种，有效提高了蚌类的鉴定水平、物种检测率及丰度评估准确度，是有效、可靠的蚌类群落结构调查新方法，具有实用价值。

技术领域

本发明涉及分子生态学领域，具体涉及一种蚌类环境DNA宏条形码引物、鉴定方法及应用。

背景技术

蚌类属软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、蚌目(Unionoida)，广泛分布于北美、欧亚大陆、中美洲、非洲和东南亚。蚌类是大型底栖动物，是生态系统中最重要的生物类群之一。作为食物链的一部分它们是小型动物如底层鱼类和一些鸟类的食物。作为滤食者，它们通过滤食营养物质、有机物和浮游生物来保持水质。它们在食物网中处于非常关键的位置，如果湖泊或是河流中的淡水双壳类消失将会引起一系列的生态问题。在最近的几十年中，全球蚌类种群密度和种类丰富程度等存在明显的下降，一些物种数量减少的速度超出了种群自我恢复能力的范围，以致一些物种濒临灭绝甚至灭绝。进入90年代全球范围内蚌类种群明显呈衰退趋势，且有学者认为蚌类是目前最受威胁的淡水生物类群。IUCN濒危物种红色名录显示，蚌类是所有动物类群中灭绝数目最多的一类(Version 2019-3.http://www.iucnredlist.org)。

传统的调查方法即直接捕捉会破坏它们的生活环境及种群大小，造成二次伤害；当濒危物种种群数量较低时，数据不够准确；依赖于分类学知识和大量的人力、物力的投入，调查成本高；违背禁渔政策。对于蚌类来说，传统的采样技术不易采集，一些物种鉴定也有困难，原因在于它们存在于在高浊度或低能见度的生境、密度低、斑片状分布、与相近物种杂交以及潜在的隐藏种。传统的调查方法似乎是违背目前的禁渔政策的、低效的、选择性的、破坏性的、或者严格依赖于不断下降的分类专业知识。因此，亟需一种不违背目前政策的、高效率、低成本和高灵敏度的方法来监测和评估其生物多样性趋势。

环境DNA宏条形码技术不仅提供了准确、快速的物种多样性监测手段，还颠覆了我们认识和解决环境问题的方式。环境DNA(Environmental DNA，eDNA)指的是可以从环境样本(例如土壤、水样、空气)中提取的总DNA，它不需要对任何目标生物体进行分离。宏条形码技术提供更为详细的物种组成信息，尤其是种以下水平的物种多样性，这些前所未有的信息将为我们重新审视环境问题提供契机。近年来，环境DNA宏条形码技术已成功应用于鱼类和浮游动物等的生物多样性监测和群落结构研究。利用环境样本监测水生生物多样性的技术已有相关专利申请公开。中国专利申请201910216942.6公开了一种基于环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法，包括取样、提取eDNA、PCR扩增、回收和纯化目的片段、构建目的片段文库、OTU聚类、建立鱼类比对数据库、OTUs代表性序列与建立的鱼类数据库的数据信息进行比对分析，确定待测水域中鱼类的物种多样性组成。该专利申请方法取样简单，检测方便、快速、精度高，检测结果准确。本课题组前期研究成果[陈金萍等：鄱阳湖流域蚌类环境DNA宏条形码引物的筛选验证]中公开了11对引物，在对蚌类进行普通PCR筛选引物时，8对引物不能稳定扩增出所有蚌，3对能够稳定扩增出所有蚌。

上述方法也还存在一些缺陷，比如上述方法是针对鱼类鉴定技术领域，缺乏针对蚌类一套基于蚌类的环境DNA宏条形码技术的环境样采集样品处理提取eDNA PCR扩增基因测序物种注释的完整监测体系的构建。现有的用于蚌类环境DNA宏条形码的引物监测的物种数不够多实用性较差，限制了它的应用。此外，参考数据库的完整性和质量直接决定了运用环境DNA宏条形码技术进行物种鉴定的可靠性和准确度，因此，针对蚌类的环境DNA宏条形码技术的数据库的需求日益迫切。

发明内容