[发明专利]格氏嗜盐碱杆菌Argonaute融合蛋白及其在标记DNA与RNA中的应用

说明书

本发明公开了一种NgAgo‑EGFP融合蛋白以及一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute（NgAgo）的标记和追踪细胞内DNA与RNA的方法。所述NgAgo‑EGFP融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示。使用转染试剂将所述NgAgo‑EGFP和向导DNA转染入细胞，可标记和追踪细胞内的DNA与RNA。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种格氏嗜盐碱杆菌Argonaute融合蛋白及其在标记DNA与RNA中的应用。

背景技术

基因编辑技术中先后发展出了ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等人工内切酶，可以实现对特定DNA的切割，结合细胞内源修复机制和其他遗传学方法，可以实现基因的敲除、敲入和精确编辑。格氏嗜盐碱杆菌Argonaute（NgAgo）发现之初，研究人员认为其具有DNA酶活性，可以成为一种新的人工内切酶，但后续研究未能提供证据证明其DNA酶活性。

发明人在前期的研究工作显示格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）Argonaute（NgAgo）可通过向导DNA（gDNA）以碱基互补配对的方式结合靶RNA，并造成RNA降解。由于NgAgo具有结合DNA与RNA 的能力，因此以期将其开发为一种针对DNA与RNA进行标记的遗传学工具。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服在细胞内标记RNA的技术难点，通过将NgAgo与EGFP构建为融合蛋白，在gDNA上添加Cy3荧光标记，并使用转染试剂将编码NgAgo-EGFP融合蛋白的信使RNA与gDNA转染到细胞中，可实现标记细胞中内源性表达的RNA。

本发明的目的是提供了一种NgAgo-EGFP融合蛋白在RNA标记与追踪方面的应用。

NgAgo-EGFP融合蛋白，由NgAgo与EGFP融合获得。具体方法是将EGFP融合到NgAgo的C末端或N末端。

所述NgAgo-EGFP融合蛋白包括SEQ ID NO.3所示的NgAgo序列和SEQ ID NO.4所示的EGFP序列。

进一步地，所述NgAgo-EGFP融合蛋白还包括N-端核定位信号、C-端核定位信号和弹性蛋白多肽。

进一步地，所述NgAgo-EGFP融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

基于所述NgAgo-EGFP融合蛋白的结构制作的类似蛋白序列改变且具有相同功能的蛋白，也应在本发明范围之内，例如不包含上述N-端核定位信号或C-端核定位信号。

一种表达NgAgo-EGFP融合蛋白的基因，是将上述NgAgo-EGFP融合蛋白按密码子表对应关系转换为cDNA序列，并针对应用对象所述物种进行密码子优化获得的基因。

一种表达NgAgo-EGFP融合蛋白的质粒，是将NgAgo-EGFP融合蛋白的基因克隆到表达载体获得。

所述表达载体包括，但不局限于瞬时表达载体、病毒载体、真核表达载体和原核表达载体，具体如表达载体pEGFP-N1、pcDNA3.1。

一种向导DNA（gDNA），为与目的RNA序列反向互补，5’端或3’端加上Cy3荧光基团标记，长度为10bp至50bp的序列片段的任一种或几种的混合物。

一种基于格式嗜盐碱杆菌Argonaute标记RNA的NgAgo RNA标记工具，包括上述NgAgo-EGFP融合基因、蛋白或质粒，还包括上述向导DNA。

一种基于格式嗜盐碱杆菌Argonaute标记RNA的NgAgo RNA标记方法，是采用上述NgAgo RNA标记工具与转染试剂共转染细胞，然后进行显微成像。

具体地，该方法包括如下步骤：