[发明专利]发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法

权利要求书

1.从微生物发酵液中分离纯化猪肌红蛋白的方法，其特征在于，采用浓缩-阴离子交换法从发酵液中分离纯化猪肌红蛋白；

所述浓缩-阴离子交换法具体是：将得到的浓缩液利用Vivaflow 200切向流过滤膜包进一步浓缩，将得到的浓缩上清上样到阴离子交换柱中，用10~15 mM，pH 9.0~10.0的Tris-HCl缓冲液进行平衡，再用1~2 M NaCl缓冲溶液进行梯度洗脱，收集洗脱浓度为20% NaCl的洗脱液，即为肌红蛋白纯品；所述阴离子交换柱采用重力柱；

所述发酵液为利用表达猪肌红蛋白的重组毕赤酵母发酵得到的，所述猪肌红蛋白的NCBI Reference Sequence为NP_999401.1；

所述猪肌红蛋白通过添加硫酸铵进行浓缩；具体步骤为：向发酵上清中缓慢加入硫酸铵粉末并搅拌至硫酸铵浓度达到50%饱和度，于1~4℃静置2 h；4℃，5000~10000 g离心25~35 min收集上清；向上清中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵浓度达到70%，于1~4℃静置过夜；5000~10000 g离心25~35 min收集沉淀；用10 mM、pH 9.20的Tris-HCl缓冲液将沉淀复溶得到浓缩液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组毕赤酵母是以毕赤酵母X33为宿主表达猪肌红蛋白；

所述发酵液的制备包括以下步骤：

（1）一级种子培养：将保存的所述重组毕赤酵母进行活化，在15~35℃，100~600 rpm的条件下培养16-18 h；

（2）二级种子培养：将一级种子液以体积比1~5%的量接种到种子培养基中，在15~35℃，100~600 rpm的条件下培养至OD₆₀₀=6~8；

（3）发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中，发酵罐培养，控制DO为20% ~40%，搅拌转速200-800 rpm，通气量0.5~2.5 VVM；

（4）发酵上清的制备：发酵至少84 h后，取发酵液离心去除菌体，上清液采用真空抽滤，并进行收集得到发酵液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用膜包截取分子量大于10 kDa的肌红蛋白。