[发明专利]发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法

说明书

本发明公开了发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法，属于生物技术领域。本发明通过在发酵液中创造性地分步添加不同浓度的硫酸铵，对表达猪肌红蛋白的重组毕赤酵母的发酵液进行浓缩，并对其进一步超滤浓缩，并对浓缩液进行纯化得到的肌红蛋白纯度达88.04％，纯化率可达66.05％，实现了从发酵液中纯化猪肌红蛋白，解决了之前猪肌红蛋白发酵液难以纯化的问题，并实现了猪肌红蛋白发酵液的高效纯化。本发明的分离纯化方法特异性高，操作条件温和，步骤简洁，纯化效果好，回收率高，成本低，速度快，益于扩大生产。

技术领域

本发明涉及发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法，属于生物技术领域。

背景技术

肌红蛋白是一种单亚基血红素蛋白，存在于一些无脊椎动物的肌肉中，也存在于大多数脊椎动物的心肌和骨骼肌中。在肌肉组织肌浆中肌红蛋白能可逆地与氧结合，具有转运和储存氧的作用，赋予了肌肉组织鲜红的颜色。近年来，随着人造肉技术的发展，肌红蛋白的添加可以使得人造肉制品更逼真地模拟真肉的颜色。

目前从发酵液中分离纯化蛋白通常有亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析，且大多依托于AKTA蛋白纯化仪。在大多报道中，最常用的是亲和层析中的His标签纯化，使目的蛋白与镍离子结合，后用咪唑洗脱，从而进行纯化。通常用于酶制剂的任何纯化标签都不能用于食品加工，所以不能采用His标签进行纯化。因而无法将常用的蛋白纯化方法直接应用于分离食品级的蛋白。

蛋白的纯化，首先得解决发酵液浓缩的问题。在利用毕赤酵母重组菌发酵生产猪肌红蛋白的时候，发酵液含有消泡剂，而消泡剂会对大多数的超滤膜造成不可逆的溶解反应，导致目的蛋白无法达到浓缩的目的。其次得解决蛋白降解的问题，猪肌红蛋白容易降解，以及工业化大规模纯化生产的问题。

发明内容

为了解决目前利用重组毕赤酵母发酵得到的发酵液，发酵液的分离和纯化存在的问题，本发明对分离和纯化工艺做了创造性的改进。针对发酵液浓缩的问题，本发明涉及的发酵液含有消泡剂，消泡剂会对大多数的超滤膜造成不可逆的溶解反应，导致目的蛋白无法达到浓缩的目的。因此超滤杯不适合用于猪肌红蛋白的浓缩。盐析虽然能够达到浓缩发酵液的目的，但是由于盐析的过程中会造成一定的损失，因此不适合处理大量的发酵液。此外，尝试了使用Vivaflow 200超滤膜包对猪肌红蛋白进行浓缩，该方法能够快速浓缩发酵液，并且有效避免蛋白的损失。为了对猪肌红蛋白进行高效纯化，本专利尝试了三种没有亲和标签的食品级纯化方法。主要可以分为以下三种：盐析-脱盐-凝胶过滤层析(AKTA)，盐析-脱盐-DEAE阴离子交换层析(AKTA)，超滤浓缩-Q阴离子交换层析(重力柱)。但是AKTA蛋白纯化仪的处理量低、纯化效率低，因此不适合于大规模的工业生产。重力柱的使用，可以提高纯化处理量，减少纯化时间，避免猪肌红蛋白的降解。超滤浓缩-Q阴离子交换层析(重力柱)具有操作简便，成本低，纯化率高等优点，可用于大规模工业生产。

本发明的第一个目的是提供从微生物发酵液中分离纯化猪肌红蛋白的方法，所述方法是利用如(a)～(c)任一所述方法从发酵液中分离纯化猪肌红蛋白；

(a)盐析-脱盐-阴离子交换法；

(b)盐析-脱盐-凝胶过滤层析法；

(c)浓缩-阴离子交换法；

所述发酵液为利用表达猪肌红蛋白的重组毕赤酵母发酵得到的，所述猪肌红蛋白的NCBI Reference Sequence为NP_999401.1。

在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母是以毕赤酵母X33为宿主表达猪肌红蛋白；

所述发酵液的制备包括以下步骤：

(1)一级种子培养：将保存的所述重组毕赤酵母进行活化，在15～35℃，100～600rpm的条件下培养16-18h；