[发明专利]多重RT-PCR同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法

说明书

本发明公开了一种多重RT‑PCR同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法，采用如下引物对组合：CSVd‑F和CSVd‑R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；CChMVd‑F和CChMVd‑R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；CVB‑F和CVB‑R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；TAV‑F和TAV‑R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；TSWV‑F和TSWV‑R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。本发明可有效检测植物病毒。

技术领域

本发明涉及园林植物分子生物学领域，特别是涉及一种多重RT-PCR同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法。

背景技术

世界范围内感染菊花的病毒已有20余种，目前我国报道的病毒有14种。病毒种类多，传播途径广，有植物“癌症”，尚无理想的防治措施，早期检疫，防治扩散，抑制传播媒介等是较为有效的防治手段。病毒的快速检测是病毒预防及治理的先决条件。

目前菊花病毒检测技术主要有生物学检测法、酶联免疫吸附法、核酸分子杂交技术、PCR技术等。生物学检测法是通过摩擦或嫁接的方法将病毒传染给某种病毒指示植物，通过观察其症状对病毒种类进行鉴定，操作简单，观察结果直观，但鉴定周期长，受环境影响较大。酶联免疫吸附法是病毒检测最常用的方法之一，抗原或者抗体与酶连接形成酶结合物，根据底物的颜色反应来判断是否存在病毒以及病毒的种类，具有快速、直观、费用较低等优势，但操作过程繁琐，特异性和灵敏度不高，且无法对类病毒和无外壳蛋白的病毒进行检测。核酸分子杂交技术是利用核酸与被标记的特异性探针杂交来检测病毒，但随PCR检测方法的应用，在病毒检测领域的应用越来越少。PCR技术短时间内能大量扩增病毒的遗传物质，具有快速、准确、灵敏度高等优点，但一次仅能检测一种病毒，在菊花栽培中，往往会发生多种病毒的复合侵染，因此明确病原需要重复多次PCR检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种采用多重RT-PCR同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法。本发明设计的多重RT-PCR技术，操作简便，检测时间短，灵敏度较高，可同时对5种病毒及类病毒进行检测，极大节省了检测时间与成本。

本发明公开了一种多重RT-PCR同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法，包括菊花B病毒(Chrysanthemum virus B，CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)、菊花矮化类病毒(Chrysanthemumstunt viroid，CSVd)以及菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chlorotic mottleviroid，CChMVd)，采用如下引物对组合：

CSVd-F和CSVd-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

CChMVd-F和CChMVd-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

CVB-F和CVB-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

TAV-F和TAV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；

TSWV-F和TSWV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

本发明所述的多重RT-PCR同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法，多重PCR反应体系如下：

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，55.3℃退火30s，72℃30s，循环35；72℃再延伸10min；4℃保存。