[发明专利]一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法

说明书

本发明公开了一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法，属于生物工程技术领域。本发明是以产猪肌红蛋白毕赤酵母工程Pichia pastoris X33‑GAP‑Mb为出发菌株，在摇瓶水平进行培养基和培养条件的初步优化。以Pichia pastoris X33‑GAP‑Mb、Pichia pastorisX33‑G1‑Mb为出发菌株，在发酵罐水平进行发酵条件优化，发现DO为30％，血红素流加浓度为150mg/L时，可显著提升猪肌红蛋白的产量，达到285.42mg/L。本发明中猪肌红蛋白的生物制造具有污染少、产品质量高等优点，具有发展前景，这对于猪肌红蛋白的工业化生产具有重要的应用意义。

技术领域

本发明涉及一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

肌红蛋白是一种存在于动物肌肉细胞中的蛋白质，在生物体中具有补铁、运输氧、呼吸等重要的生理功能，可赋予肌肉组织鲜红的颜色。近年来，随着人造肉技术的发展，肌红蛋白的添加可以使得人造肉制品模拟出真肉的颜色。

目前，猪肌红蛋白主要从心肌组织中提取。这种方法存在高成本、长周期、得率低、工艺复杂以及副产物多不利于分离等问题。而利用微生物细胞工厂异源合成猪肌红蛋白这种方法目前还未有报道，且尚无关于毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法的报道，因此很有必要开展相应研究。微生物合成法相较于传统的化学法，有着很多的优势，比如减少环境污染、产品质量稳定、下游提取相对简单，实现低成本成产的可能性更大。Impossible Foods采用甲醇诱导型的毕赤酵母生产了大豆血红蛋白。猪肌红蛋白和大豆血红蛋白均为单亚基蛋白，因此可将毕赤酵母作为生产猪肌红蛋白的宿主菌株。虽然，甲醇诱导型表达系统具有较高的表达水平，但是甲醇是一种有毒物质，在生产过程中容易造成环境污染，不适合用于食品级蛋白的生产。而以GAP启动子为代表的组成型表达已经在部分外源表达蛋白中进行了应用。但目前，采用组成型表达系统进行猪肌红蛋白的生产存在产量不高、发酵底物昂贵等问题，因此需要对发酵条件进行优化，提高猪肌红蛋白的产量。

利用重组毕赤酵母合成猪血红蛋白需要解决两个方面的难题：第一，确定重组猪肌红蛋白发酵合适的培养基，由于在此之前猪肌红蛋白从未在基因工程菌株中进行表达；第二，确定发酵策略，提高猪肌红蛋白的产量。通过对毕赤酵母表达系统有对应的高密度表达的过程控制策略的探索，从而提高猪肌红蛋白的产量。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种提高毕赤酵母工程菌株产猪肌红蛋白的发酵方法，在毕赤酵母发酵环境中加入血红素进行发酵，并且通过优化血红素的浓度、培养基中的氮源、碳源以及溶氧条件，来进一步提升猪肌红蛋白的产量。

本发明的第一个目的是提供一种提高重组毕赤酵母产猪肌红蛋白的发酵方法，所述方法是将重组毕赤酵母在含有血红素的体系中发酵，所述重组毕赤酵母表达了NCBIReference Sequence为NP_999401.1的猪肌红蛋白。

在一种实施方式中，所述毕赤酵母以Pichia pastoris X33为宿主，以GAP启动子或G1启动所述猪肌红蛋白的表达。

在一种实施方式中，所述G1启动子的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二个目的是提供一种生产猪肌红蛋白的方法，所述方法将表达猪肌红蛋白的重组毕赤酵母在含有血红素的体系中发酵，所述体系以甘油或葡萄糖为碳源；所述猪肌红蛋白的NCBI Reference Sequence为NP_999401.1。

在一种实施方式中，将OD₆₀₀＝8～10的所述重组毕赤酵母加入摇瓶或发酵罐中发酵生产猪肌红蛋白；发酵体系中含有20～40mg/L的血红素。

在一种实施方式中，在摇瓶发酵时，将重组毕赤酵母接种至发酵体系中，在25～35℃，pH＝4.0～7.0，150～300rpm发酵至少60h。