[发明专利]一种肝细胞冻存液及其制备方法和应用

说明书

本发明一种肝细胞冻存液及其制备方法和应用，所述冻存液包括以下组分：二甲基亚砜、葡萄糖、人重组白蛋白、维生素C、维生素E、羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、细胞缓冲液和氨基酸混合液。该冻存液避免了胎牛血清的使用，减少了对细胞治疗的不良影响，且成本低、成分稳定，制备方法简单，可规模化生产。

技术领域

本发明涉及细胞冻存液技术领域，特别涉及一种肝细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

细胞治疗是指利用具有某些特定功能的细胞，采用生物工程方法通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。其技术发展使得肿瘤，白血病等疾病的治疗的疾病有了新的方法。

其中L-02细胞建系鉴定于1980年(叶秀珍等，1980)。该细胞是一株正常肝细胞系，具有典型的肝细胞形态学特征，其细胞功能与正常肝细胞相似，是肝病细胞治疗中的种子细胞。L-02细胞通过细胞治疗技术在肝病治疗中可以发挥重要辅助作用。

目前，肝细胞冻存液中均含有胎牛血清。但是，由于细胞治疗中细胞与人体有接触，而胎牛血清在其中有不确定因素，可能会影响细胞治疗效果。即使离心除去冻存液，也不能完全去除胎牛血清中的影响，会在一定程度上影响后续细胞治疗的效果。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种肝细胞冻存液，该冻存液不含有胎牛血清，能进一步减少肝细胞治疗在临床上的不安全因素，同时还能维持肝细胞的细胞存活率和生物活性。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

一种肝细胞冻存液，包括以下组分：体积分数5％～10％的二甲基亚砜，体积分数为10～15％的羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，0.5～2.0g/L的葡萄糖，35～50g/L的人重组白蛋白，30～120μmol/L的维生素C，10～50μmol/L的维生素E，以及余量的混合溶液，所述混合溶液中细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比1:1～2。

优选的，所述细胞缓冲液的组分为：6800～8000mg/L NaCl、300～400g/L KCl、140～200mg/L CaCl₂、95～100mg/L无水MgSO₂、100～130mg/L Na₂HPO₄、40～55mg/L KH₂PO₄以及余量无菌水，所述细胞缓冲液的pH为7.1～7.6且其渗透压为250～290mOsm/L。

优选的，所述氨基酸混合液中含有：5～7.5mg/L甘氨酸、7～9mg/L L-丙氨酸、40～50mg/L L-缬氨酸、45～55mg/L L-亮氨酸、45～55mg/L L-异亮氨酸、25～35mg/LL-苯丙氨酸、8～13mg/L L-脯氨酸、8～13mg/L L-色氨酸、8～13mg/L L-丝氨酸、30～40mg/L L-络氨酸、12～20mg/L L-蛋氨酸、280～300mg/L L-谷氨酰胺、25～35mg/L L-胱氨酸、12～15mg/LL-天冬酰胺、120～130mg/L L-精氨酸、70～75mg/L L-赖氨酸、40～45mg/L L-组氨酸、12～15mg/L L-天门冬氨酸、13～15mg/L L-谷氨酸、0.5～1.8g/L亚硫酸氢钠、11～15g/L山梨醇，所述氨基酸混合液的溶剂为无菌水。

本发明还提供了制备上述肝细胞冻存液的方法，具体包括以下步骤：

S1、将细胞缓冲液中的各组分原料溶于无菌水中，搅拌混匀，调节pH至7.1～7.6，灭菌得到细胞缓冲液；

S2、取各类氨基酸和亚硫酸氢钠溶于含有山梨醇的无菌水溶液中，搅拌均匀即得氨基酸混合液；