[发明专利]一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统

说明书

本发明公开了一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，荧光三元相关光谱系统包括至少三个输出不同波长的激发光源，激发光源照明样品激发产生的荧光信号，荧光信号根据荧光波长分成多路信号，通过单光子探测器探测，将信号传输至信号采集卡和运算卡，并进行三元相关函数实时运算，获得荧光三元相关光谱曲线，本系统实现了荧光三元相关光谱通过对检测微区内三种发射出不同波长的荧光分子荧光波动信号进行实时记录和三元相关函数分析获得荧光三元相关光谱曲线，解析曲线的振幅与三种荧光分子复合物浓度的关系，实现三种不同分子间共同结合作用的分析，将拓展荧光相关光谱在活细胞内原位分析研究。

技术领域

本发明涉及一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，属于光谱分析领域。

背景技术

显微成像和光谱分析技术由于具有的非侵入性、高检测灵敏度等优势成为目前生命科学研究中重要的研究工具，如光活化定位显微镜技术、随机光学重构显微镜技术等。细胞内不同生物分子间通过不断的两两相互作用和三元相互作用等，进行电子转移、信号传导、功能调控等，实现细胞的生理功能。细胞内异常的分子间相互作用的发生，如多蛋白的聚集作用是很多疾病发生的基础，如克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)，并可能导致癌症。目前发展的很多技术，包括酵母双杂交法、亲和纯化-质谱分析法、免疫共沉淀法、蛋白质微阵列、超速离心分析法、表面等离子体共振分析和量热法等可以实现对分子间相互作用的离线分析。但这些方法无法实现对活细胞内分子间作用进行原位分析。

荧光相关光谱是一类具有超高灵敏度的单分子光学检测方法，是目前进行活细胞原位分析的重要工具，包括荧光自相关光谱(FACS)和荧光互相关光谱(FCCS)等。荧光自相关光谱系统通过对检测微区(1fL)内的荧光分子由于布朗运动或者化学反应造成的荧光信号的涨落进行记录，然后对荧光涨落信号进行自相关函数(Autocorrelation function，ACF)分析，得到荧光分子的荧光自相关光谱曲线，获取其浓度、扩散系数、化学反应速率常数、结合和解离常数等信息。由于FACS作为一种单分子光学分析技术，具有非侵入性、灵敏度高、空间分辨率高等特点，因此被广泛应用于在活细胞内进行测定。

荧光自相关光谱通过测定荧光分子或者荧光分子标记的生物分子的扩散系数的变化分析荧光分子或者荧光分子标记生物分子与其它分子间发生的结合作用。由于分子的扩散速率一般与分子的质量的立方根成反比，因此扩散系数的显著变化必须要求荧光分子与其它分子结合后存在质量的非常显著差异。同时，由于细胞内复杂的不均匀性、高拥挤性等特点，严重限制了荧光自相关光谱在活细胞内分子间相互作用的研究。

与荧光自相关光谱系统不同，荧光互相关光谱系统一般采用两束同轴的激光束作为激发源，采用分光光路构建了两个针对不同波长的荧光信号的检测通道。通过对从两个通道的荧光波动信号进行互相关函数(Cross-correlation function，CCF)分析，获得荧光互相关光谱曲线。荧光互相关光谱常用于运动中的两种不同的荧光分子间的相互作用分析。当两种标记不同荧光发射波长的基团的分子由于布朗运动并发生结合作用时，那么两个通道荧光信号的涨落呈现出同步性，在荧光互相关光谱分析中可获得荧光互相关光谱曲线。发生相互作用的分子比例越高，荧光互相关光谱的振幅G(0)值越大。

对比于荧光自相关光谱，荧光互相关光谱对相互结合的两分子间分子量差异没有要求，因此显著增加了对分子间相互作用分析的适用性，因此它已成为活细胞内研究分子间相互作用的重要工具之一。然而，在复杂的生命体系如细胞中很多生物功能的表达需要三种及三种以上生物分子间发生共同结合作用。荧光互相关光谱虽然可以实现分子间两两相互作用研究，但无法实现三种生物分子间共同结合作用的研究。

发明内容

本发明的研究目的是提供一种用于三种分子间结合作用解析的荧光三元相关光谱系统，该系统可实现三种不同荧光团标记的分子间结合作用的实时原位分析，突破传统的荧光相关光谱无法用于三种分子间结合作用实时解析的限制。