[发明专利]一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物及其应用

说明书

本发明提供了一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物及其应用，所述单分子标签引物包括：5’端修饰基团、核苷酸片段和3’端修饰基团；所述5’端修饰基团包括UMI分子标签和通用引物接头，其中，所述UMI分子标签与核苷酸片段的5’端相连，所述通用引物接头与UMI分子标签5’端相连；所述核苷酸序列与目标序列匹配，用于扩增所述目标序列；所述3’端修饰基团包括RNA残基、DNA保护碱基和封闭基团，其中，所述RNA残基与核苷酸片段的3’端相连，所述DNA保护碱基与RNA残基相连，所述封闭基团与DNA保护碱基相连。所述单分子标签引物特异性好，扩增效率高，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，尤其涉及一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物及其应用。

背景技术

病原微生物靶向捕获方法主要有两种：一是杂交捕获法，二是多重PCR扩增法。多重PCR扩增是指在一个反应体系中有2个以上的扩增子进行同时扩增。现有的多重PCR扩增法的主要流程为，针对某病灶样本常见的、明确的病原菌种进行多重引物设计，利用设计好的特异性多重引物在一个或多个反应管中进行第一轮多重PCR扩增，富集目标病原菌的靶区域序列；接着对扩增产物进行纯化，最后通过第二轮PCR扩增加上适合测序平台的接头序列，得到测序文库。

多重PCR扩增在单个反应中，引物的数量往往达到几百甚至几千条，必须优化每个引物集的反应程序及缓冲液各组分的比例、浓度才能保证在单个反应中正确扩增出各目标扩增子。但即使如此，多重PCR扩增依然无法很好的解决以下几类问题：引物之间形成二聚体从而相互干扰、非特异性扩增产生大量非目标扩增子影响后续的测序、重叠扩增干扰目标靶区域扩增、无法进行准确的定量、扩增均一性、扩展性及灵活性均较差等。

针对上述问题，目前也有一些针对性的改良方法，CN107532203B公开了一种重叠扩增子的选择性扩增的方法，其主要改进方案为，在正向引物F1的5’区添加一段非同源t2标签，F2中添加t1标签，反向引物R1中添加t1标签，R3中添加t3标签，依次类推；在扩增产物中，正向引物的t1与反向引物的t1反向互补，形成发夹结构，进而阻遏跨扩增子的非目标区域扩增，即达到重叠扩增子选择性扩增的目的。此技术可有效解决重叠扩增干扰目标靶区域扩增的问题，但复杂性很高，设计难度大，存在较大的局限性。

此外，CN106795569B又公开了一种减少引物二聚体扩增的方法，对多重引物进行改进设计，使扩增的非目的产物或引物二聚体产生反向互补杂交，有阻遏下一步的扩增的作用，从而达到减少多重扩增的引物二聚体、提高特异性扩增的目的。但同样的，此技术存在设计复杂，实现难度较大，同时还具有无法对多重扩增子进行准确定量及较难保证各扩增子均一扩增的缺陷，无法满足病原微生物多重扩增靶向测序并定量的应用。

目前出现的多重PCR改进技术往往只能解决部分问题，不能从整体改善扩增效果。因此，如何提供一种可以提高多重PCR扩增的方法，能够从整体上提高扩增效率，并具有良好的扩展性与灵活性，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物及其应用，本发明的利用单分子标签扩增引物，配合优化后的扩增反应体系，可以有效解决二聚体形成、非特异性扩增的问题，并且可以实现原始扩增模板的准确定量，稳定性及扩增均一性极好，具有广阔的应用前景。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种应用于绝对定量高通量测序的多重PCR扩增的单分子标签引物，所述单分子标签引物包括：5’端修饰基团、核苷酸片段和3’端修饰基团；

所述5’端修饰基团包括UMI分子标签和通用引物接头，其中，所述UMI分子标签与核苷酸片段的5’端相连，所述通用引物接头与UMI分子标签5’端相连；

所述核苷酸序列与目标序列匹配，用于扩增所述目标序列；