[发明专利]测序方法

说明书

本发明公开了一种测序方法，该方法包括提供表面连接有多个单链核酸的固相基底，单链核酸的5'末端与该表面连接，单链核酸为包含插入片段‑第一序列的多核苷酸，插入片段为来自待测样本的核酸序列，第一序列为包含标签‑第一位点的预设序列，标签为特异性对应待测样本的预设序列；提供第一测序引物，该第一测序引物能够与第一位点的5'末端杂交；以及使第一测序引物与单链核酸杂交并置于适于进行聚合测序的条件下，以通过延伸第一测序引物对单链核酸的一部分序列进行测定，获得测序结果。该多重测序方法能够有效地降低标签跳跃的水平，特别适于需准确检测混合样本中的微量物种或稀有变异的情形。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，特别地，涉及测序领域，更特别地，涉及一种适用于对标签文库进行测序的方法、一种试剂盒以及一种系统。

背景技术

下一代测序，也称为高通量测序或者大规模平行测序，能够在一次测序运行中测定多个样本的核酸序列。实现这种测定的方法之一是通过多重样本分析，多重样本分析通常也称为多重文库(multiplex library)或者多重测序(multiplex sequencing)。

进行多重测序，会在文库构建的过程中给每个DNA片段添加一段与该DNA片段来自的样本唯一对应的特异性序列，使得多个样本的文库可以混合于一个反应体系中进行测序获得测序数据，进而根据该特异性序列可将测序数据分配至相应的样本，从而获得每个样本的测序数据，这里的特异性序列通常称为标签或索引(index，barcode或者tag)。

多重文库之间的标签分配错误，也称为标签跳跃(index hopping或者indexmisassignment或者sample cross-talk)，是多重测序已知的问题。

Kircher等人较早发现了这个问题，并提出了解决方案。他们设计了双端双标签(double-indexing)试验，通过在文库两端的接头都引入标签来定量检测index hopping水平，发现在多重测序中，标签分配错误率约为0.3％，比预期的高几个数量级；同时，Kircher等人进一步披露了他们设计的该双端双标签方法通过两端的两标签交叉验证来鉴定一个样本，能够使标签分配错误率呈指数下降，显著降低index hopping水平(Kircher等,2012,Nucleic Acids Res.,Vol.40,No.1)。

而后，随着高通量测序技术的发展，特别是采用在图案化流动池(patterned flowcell)上利用ExAmp技术(exclusion amplification，排他性扩增)扩增待测核酸获得分子簇的测序平台，index hopping问题更是凸显。为此，Illumina公司提出了一种双端双标签文库策略(prepare dual Indexed libraries with unique Indexes)，在文库的P5和P7端带上独特的标签(UDI，Unique dual Index)，通过P5 Index 2和P7 Index 1成组设计，两端index交叉验证，从而解决该些测序平台凸显的index hopping问题(Illumina，2017，Effects of Index Misassignment on Multiplexing and Downstream Analysis WhitePaper)。

可以理解地，但凡涉及到利用高通量测序在一个高背景噪音干扰的混合物中寻求微量“阳性”数据的检测都非常容易受到index hopping的影响，包括癌症基因组学和其它的需要精确检测稀有变异的应用，如液体活检等。

随着测序平台和测序应用的开发和发展，有必要进一步降低标签跳跃或者提供另外的能降低标签跳跃的方法供选择。

发明内容

本发明实施方式旨在至少一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一或者至少提供一种实用的替代方案。为此，本发明实施方式提供一种测序方法。

需要说明的，本实施方式的测序方法是发明人基于以下测试总结和发现作出的：