[发明专利]一种多细胞共培养的三维肝微球模型的构建及应用

说明书

本发明公开了一种多细胞共培养的三维肝微球模型的构建及应用，属于细胞微球技术领域。本发明所述的一种多细胞共培养的三维模型的构建方法，包括如下步骤：将肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞配制为混合细胞悬浮液；之后将混合细胞悬浮液加入超低吸附孔板，培养1‑2天，得到所述的多细胞共培养的三维模型；其中所述的混合细胞悬浮液中肝实质细胞、肝星形细胞以及内皮细胞的数量比为4：1：1；所述的肝实质细胞为人肝癌细胞HepG2，肝星形细胞为LX‑2，内皮细胞为人脐静脉融合细胞EA.hy926。本发明的模型可以全方位地接触培养液和其他细胞，更加接近人体内的细胞环境，使得三维模型对于肝毒性或肝损伤的评价更为准确、可靠。

技术领域

本发明涉及一种多细胞共培养的三维肝微球模型的构建及应用，属于细胞微球技术领域。

背景技术

传统的毒理学评价通常以动物实验为基础，虽然动物可以完整地模拟整个吸收、代谢、转化、排泄的复杂过程，但是由于物种间的差异性并不能充分反应人体的生理过程，要证实动物实验的结果还需进一步的实验验证。而且动物实验周期过长、成本较高，灵敏性和特异性也比较差。随着分子生物学和现代分析技术的不断发展，越来越多的细胞模型开始用于肝毒性研究。

目前，基于二维培养的细胞模型依然是药物检测和毒性评估的主要方法。但是，二维培养环境与人体内环境差异过大，无法准确模拟体内的代谢过程，因此构建一种可以更加准确可靠模拟体内环境且经济高效的评价模型对于药物、食品的开发、评价至关重要。

发明内容

[技术问题]

动物实验周期长、成本较高，灵敏性和特异性也比较差；二维培养的细胞模型无法准确模拟体内的代谢过程；单种细胞的三维培养缺乏不同细胞间的交流，与人体内多细胞共同作用的内环境差异较大。

[技术方案]

为了解决上述至少一个问题，本发明提供了一种多细胞共培养的三维模型构建方法及其应用，选用了人体肝组织中具有重要功能的三种细胞(肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞)共培养，用于更加准确模拟体内肝代谢环境并进行肝毒性检测评估。

本发明的第一个目的是提供了一种多细胞共培养的三维模型的构建方法，包括如下步骤：

将肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞配制为混合细胞悬浮液；之后将混合细胞悬浮液加入超低吸附孔板，培养1-2天，得到所述的多细胞共培养的三维模型。

在本发明的一种实施方式中，所述的肝实质细胞为人肝癌细胞HepG2，肝星形细胞为LX-2，内皮细胞为人脐静脉融合细胞EA.hy926。

在本发明的一种实施方式中，所述的混合细胞悬浮液中肝实质细胞、肝星形细胞以及内皮细胞的数量比为4：1：1。

在本发明的一种实施方式中，所述的混合细胞悬浮液中采用的细胞培养液是由HepG2细胞的专用培养基与LX-2、EA.hy926细胞的专用培养基等比例混合配制而成。

在本发明的一种实施方式中，所述的混合细胞悬浮液中肝实质细胞的浓度为5000cells/mL，肝星形细胞的浓度为1250cells/mL，内皮细胞的浓度为1250cells/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述的超低吸附孔板为96孔。

在本发明的一种实施方式中，所述超低吸附孔板中每孔加入200μL的混合细胞悬浮液；使其自发形成细胞微球，每个微球含有1000个HepG2细胞、250个EA.hy926细胞、250个LX-2细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述的培养中，每24h需要更换一次孔板中的培养液，所述更换体积为原体积的一半。

在本发明的一种实施方式中，所述的培养是在37℃下进行培养。