[发明专利]一种模拟肌腱-骨界面的高仿生复合支架的制备方法

权利要求书

1.一种模拟肌腱-骨界面的高仿生复合支架制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

(1)肌腱-骨界面模拟骨相的制备：使用氯仿溶解PLGA，待聚合物完全溶解后，将预定质量的已过筛氯化钠和纳米羟磷灰石分散在溶液中,并加入一定量的载BMP-2明胶微球混合均匀。将混合物注入聚四氟乙烯支架模具。完成注模后于室温静置24小时后脱模，继续干燥24小时。使用去离子水浸泡支架2天，每4小时换一次水并不断搅拌。将多孔支架取出，在鼓风干燥机中干燥24小时，然后置于真空干燥箱中干燥24小时，保存在真空干燥器中，以避免降解。将支架放入超净台照紫外灯，将骨髓间质干细胞(BMSCs)细胞悬液接种到支架上。置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(2)肌腱-骨界面模拟肌腱-骨渐变相的制备：通过涡旋混合器将同浓度海藻酸钠与I型胶原溶液混匀，并在保持低温的条件下加入TGF-β3。将混合液于旋涡状态下滴加氯化钙溶液使其胶凝，样品在4℃下过夜，制得I型胶原/海藻酸钠水凝胶。将冻干后的水凝胶放入超净台照紫外灯，将肌腱细胞(TCs)细胞悬液接种到水凝胶上，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)肌腱-骨界面模拟肌腱相的制备：将PLLA溶解于氯仿中形成PLLA-氯仿溶液，装入装有钝端针头的10mL注射器中，通过使用静电纺丝设备进行纺丝。将收集到的定向PLLA的纳米纤维膜60℃加热处理2小时。

(4)不同模拟相材料的复合：将载BMP-2微球的PLGA/nHA多孔支架外部涂抹一层海藻酸钠/I型胶原混合液，通过混合液的粘性将静电纺丝膜包裹在最外部。于水凝胶层滴加氯化钙溶液进行交联，静置5min。翻转支架，再于水凝胶层滴加氯化钙交联，静置5min。将复合支架浸泡于氯化钙溶液2min后取出支架，吸干表面多余氯化钙溶液，即得。

2.根据权利要求1所述的一种模拟肌腱-骨界面的高仿生复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1中，采用粒子沥滤法制备PLGA/nHA多孔支架时所述室温范围为5～40℃，真空干燥箱温度30～40℃，压强为(0.08±0.01)MPa.，鼓风干燥机中干燥温度30～40℃。

3.根据权利要求1所述的一种模拟肌腱-骨界面的高仿生复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1中，采用粒子沥滤法制备PLGA/nHA多孔支架时：PLGA的分子量为5～15万，用量为0.1～1.0g，PLGA溶液的浓度为5～15％(w/v)，氯仿的用量为1.0～10.0mL，NaCl的粒径为100～200um用量为0.3～9.0g，PLGA与NaCl的质量比为1:3～1:9

4.根据权利要求1所述的一种模拟肌腱-骨界面的高仿生复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1中，载BMP-2明胶微球的制备方法为：在室温下将200mg明胶溶解在20ml去离子水中，直至得到澄清溶液。使用0.2mol/L氢氧化钠调节溶液pH值至7.00。搅拌条件下加入乙醇梯度置换出水以形成明胶颗粒，再加入乙二醛进行交联，室温下搅拌10h。反应结束后使用12％的焦亚硫酸钠水溶液除去乙二醛中未反应的醛基。在14000rpm下离心90min，将离心收集到的明胶颗粒用去离子水洗涤两次后进行冷冻干燥。BMP-2明胶微球的制备，明胶的羧基在添加N-乙基-N`-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC，4mg/ml)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠(NHS，4mg/mL)的MES缓冲液(100mM，pH 6)中活化1h。将活化的明胶颗粒在去离子水中透析过夜后离心且冷冻干燥，再于已加入的BMP-2水溶液的PBS中溶胀10h以装载BMP-2。最后将载BMP-2的明胶微球离心收集并冷冻干燥。其中，在100ml的最终洗脱混合液中，乙醇与水的体积比为13：7～7：13，载药微球的用量为10～40mg。

5.根据权利要求1所述的一种模拟肌腱-骨界面的高仿生复合支架的制备方法，其特征在于，步骤2中，海藻酸钠/I型胶原水凝胶浓度为8.0～10.0mg/ml，体积比为体积比2:3～3:2，通过加入盐酸或氢氧化钠，将混合物的pH值调节到7.0-7.6。实验温度为0-10℃，氯化钙浓度为0.2～1.0mol/L，TGF浓度为10～1000ng/ml。