[发明专利]一种模拟肌腱-骨界面的高仿生复合支架的制备方法

说明书

本发明为一种模拟基于腱骨界面的高仿生复合支架的制备方法，属于组织工程骨支架材料的制备技术领域。本发明中，结合腱骨界面连续渐变结构和组织工程方法特点构建高仿生复合支架，于不同模拟相负载不同生长因子，并种植骨髓间质干细胞促进修复。其中第一层采用负载BMP‑2‑明胶微球的多孔支架模拟腱骨界面的骨相，促进骨组织再生；第二层采用载TGF‑β3的海藻酸钠和胶原的复合水凝胶模拟腱骨界面渐变相；最外层采用聚乳酸定向纳米纤维模拟腱骨界面肌腱相，并具防止组织粘连和抗菌作用。本方法所制备的复合支架实现了腱骨界面异型细胞群体和基质的特异性变化，并表现出分级的力学特性和组织诱导特性，在骨组织工程中具有应用前景。

技术领域

本发明为一种基于肌腱-骨界面的组织构成和组织工程方法特点的复合支架，属于组织工 程骨支架材料的制备技术领域，特别是模拟肌腱-骨界面连续渐变结构构建一种高仿生支架， 有望用于腱-骨组织的再生修复。

背景技术

由创伤、感染、肿瘤等引起的大段骨缺损修复与重建是临床医疗的常见问题，而大尺寸 骨缺损往往伴随着严重肌腱和韧带组织损伤。肌腱-骨界面是软组织向骨转化的特殊移行区域， 由肌腱、未钙化纤维软骨、钙化纤维软骨和骨共四层组织构成，由于腱-骨界面复杂的组成结 构和特殊的生物力学功能，其重建和修复缓慢而困难。临床上，传统的保守治疗或手术由于 缺乏修复肌腱到骨的过渡区而不能有效地实现肌腱愈合和再生。采用组织工程方法构建复合 种子细胞、支架材料和生长因子的生物活性人工骨被认为是腱骨组织再生修复最有效的方法 之一。然而目前，能够用于临床的组织工程产品种类和数量都非常有限，行使的功能和结构 也相对简单，尤其缺乏一种能够模拟腱-骨界面组织结构连续渐变且细胞分化多样的高仿生组 织工程支架材料，因此现有技术方法无法对其进行有效重建和整合。我们旨在制备一种模拟 肌腱-骨界面连续渐变结构的多层生物活性支架，能够实现结构和功能的高度仿生化，从而迅 速有效地实现肌腱和骨组织的再生修复。

本发明的目的：提供一种模拟肌腱-骨界面连续渐变结构的高仿生多层生物活性支架的制 备方法。

本发明的构思：基于肌腱-骨界面的组织构成和组织工程方法的特点，构建的支架材料主 要包括三层：第一层为骨相，采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和纳米羟基磷灰石(nHA) 制备，同时加入负载BMP-2的明胶微球并种植骨髓间充值干细胞(BMSCs)，可为大段骨缺 损提供力学支撑同时诱导细胞成骨分化，促进骨再生；第二层为肌腱相，采用胶原和海藻酸 钠制备的复合凝胶材料并负载TGF-β，为种植的肌腱细胞的生长分化提供细胞外基质和诱导 因子；最外层拟采用定向排列的左旋聚乳酸(PLLA)纳米纤维膜，诱导诱导肌腱细胞的定向 分化，并具有防止组织粘连和抗菌的作用。最后，将上述三层复合，构建一种模拟肌腱-骨界 面连续渐变结构的多层生物活性支架，使其能够从结构和功能等全面促进的肌腱-骨界面的修 复和再生。

发明内容

本发明的目的主要是通过以下技术路线实现的：

(1)肌腱-骨界面模拟骨相的制备：首先制备载BMP-2明胶微球，在室温下将明胶溶解在 去离子水中，使用氢氧化钠调节溶液pH值至中性。搅拌条件下加入乙醇梯度置换出水以形 成明胶颗粒，再加入乙二醛进行交联，并在反应结束后使用12％的焦亚硫酸钠水溶液除去未 反应的醛基。通过离心收集到的明胶颗粒用去离子水洗涤两次后进行冷冻干燥。将明胶颗粒 置于活化液中活化1h。将活化的明胶颗粒在去离子水中透析过夜后离心且冷冻干燥，再于已 加入的BMP-2水溶液的PBS中溶胀以装载BMP-2。最后将载BMP-2的明胶微球离心收集并 冷冻干燥后保存备用。使用氯仿溶解PLGA，待聚合物完全溶解后，将预定质量的已过筛氯 化钠和羟磷灰石分散在溶液中,并加入一定量的载BMP-2明胶微球混合均匀。将混合物注入 支架模具，室温静置24小时后脱模，干燥24小时。用去离子水浸泡支架2天，每4小时换 一次水并不断搅拌。最后将样品取出，干燥24小时，再真空干燥24小时，即得载BMP-2明 胶微球的PLGA/nHA多孔支架。将BMSCs细胞悬液接种到支架上，置于37℃、5％CO₂的加湿培养箱中培养。