[发明专利]无细胞脂肪提取物及其制备方法、分析方法

权利要求书

1.一种无细胞脂肪提取物的制备方法，其特征在于，包括：

步骤一、将去除血细胞和其他杂质的脂肪抽吸物离心分层后，取中间脂肪层得到脂肪细胞液；

步骤二、将所述脂肪细胞液进行机械乳化后，通过冻融或震荡的方式将脂肪细胞完全破碎；

步骤三、将破碎后的脂肪细胞液离心分层后，取第三层得到提取物混合液；

步骤四、对提取物混合液进行过滤处理以最终得到无细胞脂肪提取物；

步骤五、将无细胞脂肪提取物注液使用或者冻存。

2.根据权利要求1所述的无细胞脂肪提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，通过生理盐水对脂肪抽吸物反复洗涤以去除血细胞和其他杂质；所述步骤一中的离心条件为：于1200rpm转速条件下离心3min。

3.根据权利要求2所述的无细胞脂肪提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中机械乳化过程为：将两个注射器通过2mm的鲁尔锁连接器连接后，使脂肪细胞液在两个注射器之间往复移动。

4.根据权利要求3所述的无细胞脂肪提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中冻融方式具体为：将乳化后的脂肪细胞液在-80℃条件下冷冻12h后，在37℃下解冻，完成一次冻融。

5.根据权利要求3所述的无细胞脂肪提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中震荡方式具体为：在乳化后的脂肪细胞液加入无菌破碎棒后置于超声震荡仪中，以震荡时长5min、90％功率、间隔周期30s的条件，循环震荡3次。

6.根据权利要求4所述的无细胞脂肪提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的离心条件为：于1200rpm转速条件下离心5min；所述步骤四中，通过0.22μm的过滤器对提取物混合液进行过滤处理；所述步骤五中冻存温度为-20℃。

7.根据权利要求5所述的无细胞脂肪提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤五之前还通过BCA法测定无细胞脂肪提取物中的蛋白质浓度。

8.一种无细胞脂肪提取物，其特征在于，通过权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得。

9.一种分析如权利要求8所述的无细胞脂肪提取物对脂肪移植物存活率影响的方法，其特征在于，包括：

步骤一、配置四组处理液

磷酸盐缓冲液组：取500μL脂肪和50μL磷酸盐缓冲液混合；

纳米脂肪组：取500μL脂肪和50μL纳米脂肪混合；

FE-Low组：取500μL脂肪、7.5μL无细胞脂肪提取物和42.5μL磷酸盐缓冲液混合；

FE-High组：取500μL脂肪、37.5μL无细胞脂肪提取物和12.5μL磷酸盐缓冲液混合；

步骤二、选取36只实验小鼠，将实验小鼠分为两组，在每组实验小鼠中的每只实验小鼠的背部区域选取两处注射点分别注射两种处理液；

步骤三、将每组注射完成的实验小鼠均分为三批，分别在第2周、第4周和第12周处死小鼠，获得脂肪移植物进行称重；

步骤四、选取12只实验小鼠，在每只实验小鼠背部区域的左右两侧分别注射纳米脂肪组处理液，在注射后的第1、7、14、21、28天，分别在实验小鼠背部左侧注入磷酸盐缓冲液组处理液、在实验小鼠背部右侧注入FE-High组处理液，并在注射后第12周处死小鼠，获得脂肪移植物进行称重；

步骤五、分别取步骤三和步骤四获得的脂肪移植物，进行HE染色分析、massion染色分析、免疫组化染色分析、Anti-CD31染色分析、TUNEL染色分析、脂周蛋白染色分析和Anti-Ki67染色分析。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，注射磷酸盐缓冲液组处理液及FE-High组处理液时，分别在纳米脂肪组处理液注射点的周围4点及正上方点五个点位各注射10μL。