[发明专利]检测南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增引物组、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种检测南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增引物组、试剂盒及应用。针对检测南芥菜花叶病毒存在的问题，本发明设计并筛选了具有高特异性的检测南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增引物组，并进一步设计了试剂盒和检测方法。本发明提供的试剂盒和方法特异性好，对南方菜豆花叶病毒、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和菜豆荚斑驳病毒等检疫性病毒都呈阴性反应；灵敏度高，实时荧光检测方法最低可以检测到浓度为5×10^‑2ng/μL的南芥菜花叶病毒RNA模板，核酸试纸条检测方法最低可以检测到浓度为5ng/μL的南芥菜花叶病毒RNA模板。非常适用于医疗卫生、食品安全以及进出口检疫的现场检测，易于大范围推广应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种大豆种传检疫性病毒南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增引物组、快速检测试剂盒及应用。

技术背景

南芥菜花叶病毒是我国进境植物检疫性有害生物，是正义RNA病毒科(Secoviridae)，豇豆花叶病毒亚科(Commovirinae)线虫传多面体病毒属 (Nepovirus)的成员。南芥菜花叶病毒为单链正义RNA病毒，病毒粒体为球状正二十面体，直径为25～30nm，致死温度为55～61℃，室温下体外可存活1～2 周。该病毒寄主范围广泛，可侵染涉及174属215种植物，主要危害的为葡萄、黄瓜、西葫芦、草莓。大豆、番茄、菜豆等经济作物。ArMV引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸形和耳突等，在葡萄上表现软皮和茎凹症状，在黄瓜上表现斑驳症状，严重影响农作物产量和质量。该病毒目前主要分布在荷兰、比利时等欧洲国家和美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、南非、日本等，我国尚未有报道。

目前，南芥菜花叶病毒的检测方法主要包括ELISA、RT-PCR和实时荧光 TaqMan-MGB探针RT-PCR等检测方法。但这些方法都存在局限性，ELISA方法检出限低，难以实现无症状植物中少量病毒的检测，且ELISA方法常常无法鉴别病毒种类，特异性差，而基于PCR技术的检测方法存在反应时间长、需要昂贵的热循环仪器和专业的操作人员等缺陷，难以满足口岸检疫的快速检测的需求。

交叉引物等温扩增(cross-priming isothermal amplification，CPA)是杭州优思达生物技术有限公司研发的核酸扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。根据反应体系中交叉引物等温数量的不同，CPA可分为单交叉引物等温扩增(singlecrossing cpa)和双交叉引物等温扩增(double crossing cpa) 两种类型。这两种类型反应都需要一条交叉引物(CPF)、两条扩增引物(DR、MBR)、两条解开链的外围引物(BF、BR)以及具有链置换活性的DNA聚合酶 Bst。其中，双交叉CPA具有两条交叉引物，比单交叉CPA多一条交叉引物。单交叉CPA是在对双交叉CPA机制优化后诞生的，其能够在不到一小时的时间内扩增出4个基因组DNA拷贝，具有高度的特异性，也是目前被广泛引用的交叉引物等温扩增技术。CPA自诞生起，其主要应用于肺结核分枝杆菌的检测，进行肺结核病的诊断。目前优思达公司开发了结核分枝杆菌核酸检测试剂盒 (TB-CPA)，具有较高的灵敏度和特异度，可以在2h内完成检测并出具报告，适用于基层医院和卫生所。此外，CPA在食品安全领域也开展了研究如转基因作物检测、食源性致病菌李斯特菌的检测；在动物检疫领域建立了结合试纸条的非洲猪瘟检测方法，在植物检疫性领域建立了李属坏死环斑病毒(Prunusnecrotic ringspot virus，PNRSV)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottlemosaic virus，GGMMV)的检测方法。

发明内容

本发明针对检测南芥菜花叶病毒存在的问题，提供了一种南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增快速检测试剂盒及引物，该试剂盒具有高特异性、高灵敏度、操作简单、检测快、检测结果直观的特点。

本发明首先公开了一种检测南芥菜花叶病毒的交叉引物等温扩增引物组，所述交叉引物等温扩增引物组由外围置换引物ArBF2、外围置换引物ArBR2、扩增引物ArDR2、扩增引物ArMBR2、交叉引物ArCPF2组成；