[发明专利]一种基于多功能聚乙烯亚胺介导的检测心肌梗死标志物的无标记电化学发光免疫阵列传感器

说明书

本发明公开了利用“一锅法”制备多功能聚乙烯亚胺介导的二氧化硅@金核壳纳米结构，并将其用于构建同时检测三种急性心肌梗死标志物的无标记电化学发光免疫阵列传感器。具体步骤如下：将氯金酸加入热的聚乙烯亚胺溶液中生成金纳米，冷却后再加入聚乙烯亚胺和正硅酸四乙酯形成二氧化硅壳层。反应所得沉淀与壳聚糖溶液混合后修饰电极可用于无标记电化学发光免疫分析，检测限均低至fg/mL。此外，该材料还可用于修饰阵列电极，三种目标物在10pg/mL～100ng/mL范围内有良好的线性响应，实现了样品中多种目标分析物的同时定量分析。与现有技术相比，本发明技术简单、稳定、价格低廉，灵敏度高，可广泛应用于基于生物亲和反应的多通道定量检测中，极大地缩短分析时间，提高分析通量，在电化学发光分析领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于纳米合成、免疫反应、电化学发光分析、成像分析等领域，具体涉及一种由多功能聚乙烯亚胺介导的合成二氧化硅@金核壳纳米结构的新方法，发展了一种新型无标记电化学发光免疫传感器阵列用于同时检测三种急性心肌梗死标志物。

背景技术

急性心肌梗死(AMI)是一种由冠状动脉急性、持续性缺血缺氧引起的心肌疾病，是近年来世界上致死率最高的疾病之一。大量的研究数据表明，AMI发作后的3小时内是拯救患者生命的黄金时期，因此快速、准确的诊断对于及时治疗和挽救濒死心肌具有重要意义。近年来，常以定量检测血清中AMI生物标志物的含量作为AMI临床诊断的有力依据。然而，目前检测AMI生物标志物的方法通常局限于单标志物检测，容易造成检测的假阳性。因此，开发一种新型免疫传感平台用于同时检测多种AMI标志物(心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心型脂肪酸结合蛋白(hFABP)、和肽素(copeptin)等)对于提高诊断准确率至关重要。

实际上，已有空间分辨的电化学发光传感平台用于多AMI标志物同时检测的报道。例如，Zhang等(Sens.Actuators,B:Chem.,2018,257,60-67)以钌复合物标记的链霉亲和素-生物素抗体复合物为电化学发光探针，在金电极上构建了夹心型的适配体免疫传感阵列，实现了三种AMI标志物(cTnI、cTcT、Myo)的同时检测。然而，这种基于标记方法的组装策略不仅需要另外合成发光功能化探针，引入第二种识别分子，而且操作繁琐耗时，不利于AMI快速诊断的目标。因此急需开发一种无标记的电化学发光传感器阵列用于多种AMI标志物的快速、同时检测。

纳米材料由于其具有较大的比表面积，较好的导电性，优异的催化性能和良好的生物兼容性等性质被广泛用于分析探针的构建及分析界面的组装等领域。但是，多数纳米材料的制备困难，步骤繁琐，稳定性差，不利于进一步的分析应用，因此需要简化其制备过程，提高稳定性和实用性。分枝状聚乙烯亚胺(bPEI)是一种胺类高聚物，具有特殊的网状限域结构，其分子中含有伯胺、仲胺、叔胺三种类型的胺基，因此具有强还原性和强碱性，且在水溶液中具有较高的阳离子电荷密度，通常作为联吡啶钌高效的共反应剂参与电化学发光免疫分析过程。例如，Yuan等(Anal.Chim.Acta,2018,1001,112-118)将bPEI与联吡啶钌的衍生物偶联，形成自增强的联吡啶钌-PEI复合物，通过分子内电子转移来显著提高发光效率，用于癌胚抗原的超灵敏检测。然而，bPEI的其他性质在电化学发光免疫分析领域的应用较少。实际上，bPEI的多功能特性为简单、温和、迅速地合成稳定的纳米材料，提高其实用价值方面提供了一种全新的思路，因此在构建超灵敏的无标记电化学发光免疫分析界面上具有突出的优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于多功能聚乙烯亚胺介导的同时检测三种急性心肌梗死标志物的无标记电化学发光免疫阵列传感器。

本发明包括“一锅法”制备多功能聚乙烯亚胺介导的二氧化硅@金核壳纳米结构的新方法，用于构建同时检测三种AMI标志物的无标记电化学发光免疫阵列传感器。

本发明所提供的多功能聚乙烯亚胺介导的二氧化硅@金核壳纳米结构的制备方法，包括下述步骤：

1)将氯金酸加入热的还原剂溶液中进行还原反应，生成金纳米粒子；