[发明专利]一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒

说明书

本发明公开一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，属于病毒检测技术领域，所述试剂盒包括包被有抗原的酶标板，所述抗原为原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白。本发明的试剂盒的酶标板包被有抗原，抗原为原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54三种蛋白，采取极低的抗原含量进行包被，且经特异性试验，试剂盒与其他主要猪病无交叉反应，特异性好；灵敏度较高、重复性好、保存期长，非洲猪瘟病毒p72、p30和p54三种蛋白的组合使用对不同时期抗体均能够有效检出，为临床猪群感染情况提供依据，对于预防和控制非洲猪瘟病毒感染具有重要作用。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术

非洲猪瘟（Afican swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fevervirμs,ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度致死性传染病。其特征为病程短、病死率可高达100％，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血发绀、流产、水肿及脏器出血，在诊断时极易误诊。

1921年，ASF最初出现在肯尼亚，上世纪五、六十年代在非洲、欧洲、南美洲等国家流行。近几年，ASF传播到格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯联邦等我国周边国家，有不断蔓延趋势，使我国养猪业面临严重威胁。

非洲猪瘟病毒是ASF样病毒科的唯一成员，病毒粒子的直径为175～215纳米，呈20面体对称，有囊膜，基因组为双股线状DNA，病毒基因组全长为170～190kb，中央有125kb 左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因。该病毒主要以巨噬细胞为感染靶细胞，并以其特有基因数量众多、机制复杂的病毒蛋白参与ASFV吸附、入侵宿主细胞、病毒复制与装配、逃避宿主免疫防御系统等功能，使病毒能够更有效地感染宿主细胞，引起猪的急性、热性、出血性的临床症状和病理损害。此外，非洲猪瘟存在复杂的感染循环方式，隐性感染猪以及受猪瘟病毒污染的生猪产品及其制品是非洲猪瘟引入健康地区猪群的重要传播媒介，该病毒还可感染野猪和软蜱，可在家猪与野猪之间、野猪与软蜱之间以及家猪与软蜱之间循环传播。

由于ASFV感染机制复杂，目前尚无有效疫苗可以用于预防及治疗，短期内，依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制，采用严格的监测计划，一经发现采取大范围扑杀方式切断传染源。迄今为止，非洲猪瘟主要的诊断是在病毒基因检测的基础上，通过RT-PCR和部分基因组序列分析进行的，在病毒含量低的情况下不能及时给出是否感染的准确判断，另外，由于弱毒变异株的出现以及个体并非持续排毒，给核酸检测带来不小的挑战，再者，非洲猪瘟病毒的免疫原性很低，只有少数蛋白具有免疫原性，而且，不同个体蛋白的免疫敏感性不一致，单纯使用一种蛋白或两种蛋白进行检测，易造成漏检情况，因此，临床上需开发出快速准确、特异、敏感有效的检测手段。

发明内容

针对目前现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒。

基于上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括包被有抗原的酶标板，所述抗原为原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白。

所述非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白的质量比为1:1:1。

包被有抗原的酶标板的制备方法，包括以下步骤：用包被液将抗原稀释成浓度为0.1μg/ml的抗原溶液后，酶标板每孔中添加100μL抗原溶液(抗原包被量10ng)，封板，于2-8℃下，包被16-24h，洗涤酶标板，除水分，加入封闭液，封闭、干燥，得包被有抗原的酶标板。

所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、显色液、酶标记结合物、终止液、非洲猪瘟病毒阳性猪血清对照和非洲猪瘟病毒阴性猪血清对照。

所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，所述封闭液为含3%BSA的磷酸盐缓冲液，酶标记结合物为酶标羊抗猪二抗。