[发明专利]一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)分离华通氏胶；

2)将华通氏胶组织块经生理盐水洗涤后剪成1～2mm³大小，使其均匀铺于明胶预先包被的培养皿中，37℃放置2h后，加入第一培养基进行培养；培养过程中，在组织块上面放置无菌的盖玻片以促进组织块贴壁和间充质干细胞的生长；所述第一培养基主要由DMEM高糖培养基、胎牛血清、抗生素组成，其中胎牛血清体积占比为7.5-15％；

3)待第一培养基培养至细胞生长状态稳定，改用第二培养基进行传代培养；所述第二培养基主要由DMEM高糖培养基、胎牛血清、抗生素和间充质干细胞生长添加物组成，其中胎牛血清体积占比为7.5-15％，间充质干细胞生长添加物体积占比为0.1-0.3％；

4)传代两次后，后续重新换回第一培养基进行培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中分离华通氏胶包括如下步骤：无菌条件下获得胎儿的脐带组织，无菌生理盐水清洗并弃去血管变形处以及开口两端，撕开脐带，用组织镊剔除两条动脉、一条静脉和脐带外膜，留下内膜，内膜即为华通氏胶。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脐带取自正常足月剖宫产胎儿。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中加入第一培养基进行培养，前3天静置培养，第4天补加第一培养基3～4ml，观察生长情况，之后每2～3天换液一次，待大部分组织快均有细胞爬出时，去掉组织块，换液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中明胶预先包被的培养皿，明胶包被条件为4℃过夜。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中待第一培养基培养至细胞生长状态稳定是指：用第一培养基对间充质干细胞进行原代培养至细胞融合度达到70～80％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养基、第二培养基中抗生素的含量为：100-150U/mL青霉素、100-150μg/mL链霉素和0.25-0.75μg/mL两性霉素B。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)至4)中所述培养为在37℃、5％CO₂环境中培养。