[发明专利]一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法

说明书

本发明涉及一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法。本发明提供了三联培养基序贯培养法，该方法的脐带MSCs原代分离培养采用主要由DMEM高糖培养基、胎牛血清、抗生素组成的第一培养基，并在组织块上放置无菌的盖玻片以促进组织块贴壁和间充质干细胞的生长；待第一培养基培养至细胞生长状态稳定，改用主要由DMEM高糖培养基、胎牛血清、抗生素和间充质干细胞生长添加物组成的第二培养基进行传代培养；传代两次后，后续重新换回第一培养基进行培养。试验证明，该方法分离培养的MSCs能够用于再生医学相关研究领域。本发明的方法极大地降低了分离、培养人脐带间充质干细胞的成本，步骤简单、成功率高，适用于人脐带间充质干细胞的大规模培养。

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类来源于中胚层和外胚层并且具有自我更新、多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、胎盘、月经血、脐带血和脐带组织中，目前已成为基因治疗领域中极具实用价值的细胞来源。不同来源的MSCs具有相似的形态和表面标志物，同时也具有相似的生物学特性，但是不同的MSCs数量有所差别，其分离方法也各不相同。脐带MSCs是存在于脐带华通氏胶(Wharton's jelly)和血管周围组织中的一种干细胞。脐带MSCs的组织来源广泛，取材方便，易于采集和运输，免疫原性低，生物学特性稳定，无异体排斥反应，分离培养相对简单，对捐献者无损害以及无伦理学限制，正逐渐成为干细胞在未来医疗应用上的理想选择和研究热点之一。

人脐带长度约60cm，大约40g，是一种胶状的结蹄组织，如何简单、经济、高效地从脐带组织中分离到脐带MSCs是科研人员急于攻克的难题。目前脐带MSCs原代分离的方法主要有酶消化法及组织块贴壁法。酶消化法需要使用多种酶，加上某些酶比如胶原酶等可能涉及动物来源，并且价格昂贵，经济成本高；加上该方法操作繁琐、消化时间较长，消化程度难于把控，特别是消化时间过长容易损伤细胞，导致细胞大量死亡，细胞得率偏低。而组织块贴壁法的操作简单易行，经济成本较低，但是细胞爬出时间太慢，并且原代培养时间太长，容易引起细胞老化，细胞纯度不够，进而影响该类细胞的临床应用。

公告号CN 109337867 B公开了一种脐带间充质干细胞分离方法，该方法综合了组织块法和酶消化法，虽然能够提高间充质干细胞的分离效率和细胞数量，但是该方法使用了胶原酶、选择培养基和生长因子，成本昂贵，不利于间充质干细胞的规模化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法，该方法不但提高了间充质干细胞的分离效率和细胞数量，而且还极大地降低分离培养人脐带间充质干细胞的成本，适用于间充质干细胞的规模化生产。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种三联培养基序贯培养人脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

1)分离华通氏胶；

2)将华通氏胶组织块经生理盐水洗涤后剪成1～2mm³大小，使其均匀铺于明胶预先包被的培养皿中，37度放置2h后，加入第一培养基，并在组织块上面放置无菌的盖玻片以促进组织块贴壁和间充质干细胞的生长；所述第一培养基主要由DMEM高糖培养基、胎牛血清、抗生素组成，其中胎牛血清体积占比为7.5-15％；

3)待第一培养基培养至细胞生长状态稳定，改用第二培养基进行培养；所述第二培养基主要由DMEM高糖培养基、胎牛血清、抗生素和间充质干细胞生长添加物组成，其中胎牛血清体积占比为7.5-15％，间充质干细胞生长添加物体积占比为0.1-0.3％；

4)传代两次后，后续重新换回第一培养基进行培养。