[发明专利]成人Ph-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种成人Ph‑B‑ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于包括探针、缓冲液、杂交混合液、连接酶混合液，所述探针为13个，13个探针分别为IKZF1、EBF1、CDKN2A/B、PAX5、ETV6、BTG1、RB1、SHOX‑AREA、CRLF2、CSF2RA、IL3RA、P2RY8探针。本发明采用MLPA(P335)试剂盒，可以同时检测13个基因缺失，无需患者大量骨髓单个核细胞标本，避免患者身体受到损伤。本申请的MLPA(P335)试剂盒成本相对较低，技术难度低，测试时仪器要求低，应用标本量小，并且可以一次实验同时检测多例患者的13种基因的缺失及扩增情况，可以很好地协助临床对成人ALL患者预后的评价，指导治疗。概括：检测基因全面，意义大，方便，快捷，易操作，成本低。

技术领域

本发明涉及急性淋巴细胞白血病检测领域，尤其涉及成人 Ph^-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法。

背景技术

成人急性淋巴细胞白血病(ALL)的预后明显差于儿童ALL，随着儿童特点治疗方案的应用，成人ALL的疗效有了明显改善。但是，尽管采用同样的方案治疗，有一部分成人ALL(包括低危组)患者，预后仍然较差。成人ALL预后相关因素的研究明显落后于成人急性髓系白血病(AML)，较常用的危险因素仍以传统的诊断时白细胞计数、诊断分型、年龄、细胞遗传学异常、微小残留病等为主；而分子学异常用于预后评估缺乏共识。国际上儿童ALL的研究越来越多聚焦于一些特殊基因的分子学异常，比如IKZF1基因缺失与较差的预后相关；近期Stanulla等发现，IKZF1缺失常伴有其他基因缺失(如： CDKN2A/2B,PAX5，PAR1等基因)，定义并分析了IKZF1^PLUS基因异常的发生率、临床特点以及患者的生存分析，提出IKZF1^PLUS基因异常与更低的EFS及更高的累计复发率相关，提示非常差的预后。我们前期曾应用PCR或者MLPA的方法分析我们诊疗中心收治的成人B-ALL患者IKZF1基因缺失的情况，并进行了预后分析，得出 IKZF1缺失同样预示预后较差。但IKZF1基因缺失发生率(不同方法学)、伴发的子学异常、预后意义(尤其是不同疾病亚型的预后意义)在不同的研究报告中仍不一致。

成人急性淋巴细胞白血病(ALL)的预后首先要进行检测，目前能使用的检测手段很多，但是都存在很大缺点，如RNA-seq法检测成本高，技术难度大，大多数医院无法实现，并且费用高昂加重病人经济负担；用PCR的方法检测，无法实现同时检测13种基因的缺失，需要多次重复相关实验步骤，并且需要大量的病人骨髓单个核细胞标本，容易增加患者身体负担。

发明内容

根据以上技术问题，本发明提供一种成人Ph^-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于包括探针、缓冲液、杂交混合液、连接酶混合液，所述探针为13个，13个探针分别为IKZF1、EBF1、 CDKN2A、CDKN2B、PAX5、ETV6、BTG1、RB1、SHOX-AREA、 CRLF2、CSF2RA、IL3RA、P2RY8探针。

一种成人Ph^-B-ALL预后相关基因拷贝数变异检测方法，其特征在于利用MLPA技术进行检测，其具体检测方法为：

一、标本采集及单个核细胞的分离并提取骨髓单个核细胞的DNA；

二、MLPA步骤：

(1)DNA变性：取5ul(20ng/ul)的样品，98℃处理5min，温度降到25℃暂停；

(2)探针与DNA的杂交：取出上述步骤的样品，降至室温，加入3ul 的杂交混合液，其中1.5ul SASLAS probemix、1.5ulMLPA缓冲液，然后升温至95℃，保持1分钟，在进行60℃温浴18h，得到杂交探针；

(3)进行杂交探针的连接：

A、PCR仪降到54℃，打开管盖；