[发明专利]施旺细胞的制备方法及应用

说明书

本发明提供一种施旺细胞的制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：获取干细胞；提高所述干细胞中缝隙连接蛋白43的表达量；诱导培养缝隙连接蛋白43的表达量提高后的所述干细胞分化为施旺细胞。本发明的制备方法将蛋白表达调控和细胞诱导结合起来，通过提高干细胞中缝隙连接蛋白43的表达量来改变干细胞的细胞学特性，以提高施旺细胞的制备效率及细胞性能，降低了诱导成本，缩短了诱导时间，可得到功能更稳定的施旺细胞，增强施旺细胞对神经损伤的再生修复作用。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种施旺细胞的制备方法及应用。

背景技术

成熟分化的神经元细胞曾被认为不具有自发再生能力，目前观点认为轴突再生障碍和神经前体细胞分化与宿主细胞所处的微环境有关。诸多研究表明，施旺细胞(schwann，SCs)是影响神经微环境的重要因素。施旺细胞的胞核呈长卵圆形，其长轴与轴突平行，核周有少量胞质。由于施旺细胞包在轴突的外面，故又称神经膜细胞，它的外面包有一层基膜。施旺细胞最外面的一层胞膜与基膜一起往往又称神经膜，光镜下可见此膜。当周围神经损伤时，施旺细胞发生形态行为学的改变，分泌多种神经营养因子、改善神经细胞微环境，引导轴突再生。施旺细胞在神经再生方面具有重要作用，许多外周神经鞘由施旺细胞组成。神经损伤时，施旺细胞还具有吞噬作用。同时，施旺细胞构建神经再生通道帮助神经修复。损伤的神经轴通过芽生穿过施旺细胞构建的通道到达目标器官或组织。但是如果缺乏施旺细胞与神经轴的连接，神经轴就会死亡，神经修复也不会发生。因此施旺细胞对周围神经修复、再生具有重要作用，并且不可或缺。虽然早在1995年就发现移植施旺细胞和支架成分能促进轴突再生，但这需要足量的施旺细胞提供神经营养物质和趋化因子，如何获得满足移植数量的施旺细胞是亟待解决的问题。成体施旺细胞采集通常需要自体样本手术采集，容易导致神经周围组织甚至神经组织的二次损伤，而且采集到的数量有限，体外分离和培养均比较困难。

随着细胞研究的发展，发现干细胞具有多向分化能力潜能，来源相对简单，且干细胞移植近年被尝试用于治疗神经系统疾病。例如文献报道，脂肪源性间充质干细胞(ADSCs)经多步诱导可以体外定向分化成施旺细胞，分化后的施旺细胞能促进神经元的轴突生长，且新生长的轴突具备兴奋传递的功能。目前，脂肪源性间充质干细胞分化为施旺细胞常采用化学法和与施旺细胞共培养法来实现，但是这两种方法都存在一定的弊端。化学诱导法需要添加多种生长因子等活性成分，诱导成本非常昂贵，为了达到好的效果还需要预诱导，程序繁琐。共培养法是利用施旺细胞与脂肪源性间充质干细胞共培养的原理，但是施旺细胞在体外很难培养，常常受到成纤维细胞的污染。

发明内容

基于此，有必要提供一种效率以及纯度较高的施旺细胞的制备方法。

一种施旺细胞的制备方法，包括以下步骤：

获取干细胞；

提高所述干细胞中缝隙连接蛋白43的表达量；

诱导培养缝隙连接蛋白43的表达量提高后的所述干细胞分化为施旺细胞。

本发明的施旺细胞的制备方法将蛋白表达调控和细胞诱导结合起来，通过提高干细胞中缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达量改变干细胞的细胞学特性，以提高施旺细胞的制备效率及细胞性能，增强施旺细胞对神经损伤的再生修复作用。Cx43的表达量提高后的干细胞经过诱导分化后能呈现出更成熟的施旺细胞的形态特征，且所需时间比蛋白表达量未提高的对照组少，纯度也更高。与对照组相比，Cx43表达量提高的干细胞分化所得的施旺细胞，能更高地表达S100β、GFAP、p75NTR等施旺细胞特征标记基因，以及分泌更多的BDNF、NGF等神经营养因子，从而能更好地发挥施旺细胞调控组织微环境的作用，有利于促进后续的轴突再生和神经修复。

在其中一个实施例中，通过外源转入缝隙连接蛋白43基因以提高所述干细胞中缝隙连接蛋白43的表达量。

在其中一个实施例中，所述外源转入缝隙连接蛋白43基因的方法包括以下步骤：使用含有缝隙连接蛋白43基因的病毒载体转染所述干细胞。