[发明专利]一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法

说明书

本发明涉及植物基因工程技术领域，且公开了一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法，所述CRISPR/Cas9载体p7N‑EC通过下列步骤制备获得：获得目的序列EC1.2en‑1.1p，具体地，该目的序列通过以下步骤制备获得：先获得含有目的序列EC1.2en‑1.1p的载体pHEE401E‑ccdB，以pHEE401E‑ccdB载体为模板，利用Primer5软件设计引物，通过PCR扩增获得EC1.2en‑1.1p目的序列，利用SbfⅠ、BstBⅠ两种酶对pRGEB32‑GhU6.7‑NPT Ⅱ载体进行双酶切去除Ubiquitin启动子得到线性载体，然后与获得的EC1.2en‑1.1p目的序列进行In‑fusion连接。该新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法，能对棉花基因组进行有效的基因编辑，且具有一定的基因编辑效率。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种新型CRISPR/Cas9基因编辑载体的载体制备方法。

背景技术

CRISPR/Cas9技术是一种RNA引导的基因组编辑技术，能对基因进行精确性敲除、敲入和替换等，从而实现探究基因功能和修复致病基因等目的，该技术凭借操作简便、价格低廉、可对基因位点进行编辑和拓展性强等优势，在近几年迅速发展完善，已成为继锌指核酸酶(ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)之后的第三大基因组编辑技术。

用于基因组编辑的CRISPR/Cas9系统的主要组成部分包括DNA切割酶Cas9，以及由反式激活的crRNA(tracrRNA)和CRISPR RNA(crRNA)合成的向导RNA(sgRNA)(Jinek etal.，2012)，Cas9扫描目标基因组，首先寻找3-8-nt长的间隔邻近基序(PAM)序列，然后使用gRNA向导序列(20-nt)进行目标识别，并在PAM上游的目标序列三个核苷酸处生成位点特异性双链断裂(DSB)(Penewit et al.，2018)，这些双链断裂导致宿主细胞中DNA修复系统的激活，通常通过非同源末端连接途径(NHEJ)，由于修复路径容易出错，因此在修复过程中将引入小的缺失或插入，从而产生突变(Voytas 2013)。CRISPR/Cas9技术的一些创造性和独特的设计使该系统成为许多用户更感兴趣的工具，已被广泛用于水稻、高粱、玉米、小麦等禾本植物和许多其他重要草类植物的位点特异性诱变。

尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术应用非常广泛且基因编辑效率相对较高，但在陆地棉的应用中仍存在有大量嵌合体的现象而影响基因编辑效率，根据其工作原理可知，影响CRISPR/Cas9系统编辑效率的关键因素分别是Cas9蛋白、sgRNA和PAM序列，而这里我们想通过使用调控Cas9蛋白高效表达的启动子来提高Cas9蛋白的含量以提高该系统在陆地棉应用中的编辑效率。

有研究表明DD45/EC1.2(At2g21740)是一个卵细胞特异性基因，组织切片原位杂交显示卵细胞中有EC1.2转录本，而GUS活性和GFP信号在EC1.2p:GUS和EC1.2p:GFP转基因受精卵和早期胚胎中均有表达，携带到胚胎发生后期的信号可能是由于报告mRNA和(或)蛋白的稳定性较高所致，由EC1.2启动子驱动的Cas9在卵细胞中被特异性转录，Cas9 mRNA由于mRNA的稳定性而存在于单个细胞期胚胎中，并继续翻译Cas9蛋白，此外，新翻译的Cas9和由于Cas9蛋白稳定性而留下的残留Cas9将在单细胞期胚胎中起作用，从而允许产生拟南芥T1纯合或双等位突变体，而不是嵌合植物，而融合2个卵细胞特异性启动子产生的复合启动子EC1.2en-1.1p导致T1突变效率比单个启动子更高(Wang et al.，2015)。

发明内容

本发明的目的在于通过改造原有的CRISPR/Cas9系统以提高其对棉花基因组的编辑效率，本发明基于pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ(Wang et al.，2018)载体，以EC1.2en-1.1p取代原有系统中驱动Cas9蛋白表达的水稻Ubiquitin启动子，在棉花中构建新型具有基因组编辑能力的载体，分别选取棉花内源Gh_A06G0606和GhCLA为目标基因验证改造后的新系统在棉花中的编辑效率。