[发明专利]一种促进人胚胎干细胞均一分化为限定性内胚层细胞的方法

说明书

本发明公开了一种促进人胚胎干细胞均一分化为限定性内胚层细胞的方法。本发明提供了一种促进人胚胎干细胞分化为限定性内胚层细胞的方法，包括如下步骤：在促进人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化的过程中，在分化培养基中加入G1期抑制剂，实现促进人胚胎干细胞分化为限定性内胚层细胞。本发明采用G1期小分子抑制剂进行干预，没有引入外源基因的风险；本发明通过添加Palbociclib，显著提高限定性内胚层细胞强阳性SOX17细胞亚群比例。本发明对于获得更高比例的强阳性SOX17细胞进而提高DE细胞均一度，增强其分化能力而言具有重要意义。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种促进人胚胎干细胞均一分化为限定性内胚层细胞的方法。

背景技术

人胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)是来源于源于着床前囊胚内细胞团(Inner cell mass，ICM)的一类具有自我更新和多项分化多潜能干细胞，广泛应用于个体发育研究和干细胞治疗，如糖尿病和神经退行性疾病等。探明干细胞分化效率的限制因子，在很大程度上可以促进其临床应用。

近年来研究发现，人ESCs在向中内胚层分化过程中采用了不均等分裂，同时产生近似起始干性状态的未分化细胞和分化的中内胚层细胞；然而，该过程主要与细胞内部信号分子的极性分布有关，难以适用于细胞亚群之间的干预调控。通过大规模基因缺失研究可以筛选提高干细胞分化效率的关键信号分子；然而，目前基于基因转染进行干预的方法存在转染效率低或者引入外源基因的风险。小分子化合物具有高效、无基因组污染的优点，正逐渐成为诱导干细胞分化的主要工具。

限定性内胚层(definitive endoderm，DE)是胚胎发育过程中的一个重要的阶段，DE细胞是可以进一步分化为肝脏、胰腺、肺脏、肠管等组织的细胞。SOX17不仅是DE细胞的标记分子，而且是调控DE定向分化的关键转录因子。SOX17强阳性的DE细胞较SOX17弱阳性的DE细胞，具有更强的定向分化能力和应用价值。

因而，探明人ESCs向限定性内胚层细胞异质性分化的关键因子，筛选出合适的小分子化合物，提高分化而成的限定性内胚层细胞中SOX17强阳性细胞比例，促进干细胞均一分化，是目前干细胞研究领域的关键问题。

发明内容

本发明的目的旨在针对人ESCs向限定性内胚层细胞异质性分化的问题，提供一种促进人胚胎干细胞均一分化为限定性内胚层细胞的方法。在本发明中，“均一”具体含义为“提高由人胚胎干细胞分化而成的限定性内胚层细胞中SOX17强阳性细胞比例”。

第一方面，本发明要求保护一种促进人胚胎干细胞分化为限定性内胚层细胞的方法。

本发明所提供的促进人胚胎干细胞分化为限定性内胚层细胞的方法，可包括如下步骤：在促进人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化的过程中，在分化培养基中加入G1期抑制剂，实现促进人胚胎干细胞分化为限定性内胚层细胞。

该方法与不加入G1期抑制剂的常规方法(常规方法与本发明方法相比差别仅在于不加入G1期抑制剂)相比，能够提高由人胚胎干细胞分化而成的限定性内胚层细胞中SOX17强阳性细胞比例。

在本发明中，所述SOX17强阳性细胞是指：由人胚胎干细胞分化而成的限定性内胚层细胞群体，经流式细胞检测，会先后出现两个SOX17阳性细胞峰，第一个出现的SOX17阳性细胞峰所对应的细胞定义为SOX17弱阳性细胞；第二个出现的SOX17阳性细胞峰所对应的细胞定义为SOX17强阳性细胞。下同。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：

(A1)将人胚胎干细胞在额外添加有G1期抑制剂的第一阶段诱导培养液中诱导培养，使人胚胎干细胞分化为中内胚层细胞；

(A2)将步骤(A1)所得中内胚层细胞在额外添加有G1期抑制剂的第二阶段诱导培养液中诱导培养，使中内胚层细胞分化为限制性内胚层细胞。