[发明专利]一种欧洲型PRRSV-N蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种欧洲型PRRSV‑N蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体的制备方法及其在制备用于检测欧洲型PRRSV感染的免疫检测工具中的应用。本发明以欧洲型PRRSV‑N蛋白为免疫原免疫小鼠，制备阳性单克隆杂交瘤细胞株，并通过诱生腹水与纯化，得到欧洲型PRRSV‑N蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体具有特异性好、敏感度高、纯度高的优点，具备较高检测灵敏性与特异性，为进一步应用于欧洲型PRRSV病原的检测奠定基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种欧洲型PRRSV-N蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，其能引起母猪繁殖障碍及育肥猪呼吸系统疾病，并伴有轻度神经症状，严重时可造成全身病毒血症，在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。近年来，由于基因重组导致不断有新毒株(例如NADC30，NADC30-like)出现，使得对PRRS防控的难度增加。根据病毒基因特征和全球范围内流行状况可将PRRSV分为1型(欧洲型)和2型(美洲型)，在我国主要流行的是2型，但是近几年欧洲型在我国的流行的已有苗头，PRRSV基因组长15.2Kb，含有10个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，相邻开放阅读框之间存在短的重叠序列。其中由ORF7编码的核衣壳蛋白N占病毒总蛋白的20-40％，具有强免疫原性，在PRRSV感染猪一周左右即可刺激机体产生特异性抗体，并持续数月之久。自2018年爆发非洲猪瘟后，国内大企业从国外引进种猪较多，欧洲型PRRSV有可能随之广泛传播，因此有必要建立一种欧洲型PRRSV检测方法，为接下来研究欧洲型PRRSV打下基础。

大肠杆菌由于操作相对简便和制备成本低廉，成为体外表达外源基因的首选系统，但其表达的外源蛋白大都是以非可溶性的包涵体形式存在，与天然活性蛋白差距甚远，限制了其应用。谷胱甘肽巯基转移酶标签蛋白(GST)是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26kDa，由于GST是一个可增加外源蛋白可溶性的高度可溶蛋白，同时可在大肠杆菌中大量表达，提高外源蛋白表达量，因此GST得以在原核表达中大量应用；Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高；MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码，MBP融合在蛋白的N端或C端，可增加在细菌中过量表达的融合蛋白尤其是真核蛋白的溶解性，同时MBP标签可通过免疫分析很方便地检测；6×His是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端，His-tag有以下几个优点：标签的分子量小，只有0.84kDa；His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化；His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

PRRSV N蛋白是一种碱性蛋白，局部亲水性较好，通过调整表达条件和添加促溶标签等方式即可实现其在大肠杆菌的可溶性表达，表达后经Western blot验证其免疫原性，即可得到大量高纯度的重组N蛋白。

综上，有必要提供一种体外制备RRSV N蛋白单克隆抗体的方法，对后续开发其他检测方法，对跟踪监测、预防控制欧洲型PRRSV在我国流行趋势均有重要意义，同时为进一步探究N蛋白的抗原表位、建立PRRSV诊断方法奠定物质基础。

发明内容