[发明专利]一种右旋糖酐蔗糖酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种右旋糖酐蔗糖酶及其制备方法和应用，属于基因工程领域。本发明根据肠膜明串珠菌右旋糖酐蔗糖酶编码基因序列，利用易错PCR合成方法获得了右旋糖酐蔗糖酶突变体，突变后的序列核酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步优化大肠杆菌表达系统对该所述突变的右旋糖酐蔗糖酶编码基因进行高效分泌表达，获得右旋糖酐蔗糖酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。与野生酶相比，突变的右旋糖酐蔗糖酶可催化获得单一分子量区间的微分子量右旋糖酐。

技术领域

本发明属于酶制备领域，具体涉及一种右旋糖酐蔗糖酶及其制备方法和应用。

背景技术

右旋糖酐(dextran，dex)又叫α右旋糖酐，是葡萄糖单元经脱水后所构成的高分子多糖化合物。微分子右旋糖酐能改善微循环，消除血管内红细胞聚集，防止血栓形成及渗透利尿的作用，可用于治疗急性失血性休克、心肌梗塞、脑血栓、脑供不足、周围血管病及防止弥散性血管内凝血和肾功能衰竭等功效。微分子量右旋糖酐主要存在以下缺陷：(1)目前双酶法或多酶法生产微分子量右旋糖酐成本高、纯化困难，需要两步才能完成(2)胞内表达的蛋白质易在菌体内形成包涵体，且纯化前还需要经过耗时且成本较高的细胞破碎步骤。因此，构建右旋糖酐蔗糖酶突变体的大肠杆菌高效分泌表达菌株能一步催化生产微分子量右旋糖酐，同时解决该酶胞内表达时存在的问题。

发明内容

本发明通过对右旋糖酐蔗糖酶氨基酸序列进行突变改造，再在其编码基因上连接分泌表达信号肽，以利于其在大肠杆菌中实现分泌表达，从而高效快速地获得可生产单一分子量(4000～5000)右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶。

本发明的第一个目的是提供一种右旋糖酐蔗糖酶，具体为一种催化生产微分子量右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶突变体DexT1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供上述右旋糖酐蔗糖酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供上述右旋糖酐蔗糖酶的编码基因的分泌表达信号肽，所述分泌表达信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述信号肽编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第四目的是提供一种含有上述右旋糖酐蔗糖酶编码基因以及信号肽编码基因的重组载体。

优选的，所述重组载体所用的表达载体为pET28a(+)。

本发明的第五目的是提供一种基因工程菌，以大肠杆菌BL21为宿主细胞，通过载体表达连接上述右旋糖酐蔗糖酶编码基因以及信号肽编码基因。

本发明的第六目的是提供上述右旋糖酐蔗糖酶的制备方法，步骤如下：将右旋糖酐蔗糖酶及其分泌表达信号肽的编码基因和表达载体pET28a(+)相连接，并将连接产物转化至大肠杆菌BL21，获得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组突变内右旋糖酐蔗糖酶的表达；离心获得含权利要求1所述右旋糖酐蔗糖酶的酶液；对酶进行活性测定。

本发明的有益技术效果是：与一般右旋糖酐蔗糖酶相比，右旋糖酐蔗糖酶突变体DexT1可以直接一步酶催化生产分子量在4000～5000之间的右旋糖酐，且催化较为稳定，分子量分布较为集中，免去了先催化生成高分子量右旋糖酐再水解生产微分子量右旋糖酐的步骤，同时在右旋糖酐蔗糖酶的N端加入DsbAT信号肽实现了右旋糖酐蔗糖酶在胞外的高效分泌，。本发明的突变右旋糖酐蔗糖酶DexT1可应用于药物行业等生物技术领域。

附图说明

图1 DsbAT-DexT1的PCR扩增结果。

图2工程菌pET28a-DsbAT-DexT1菌落PCR结果

图3质粒pET28a-DsbAT-DexT1的构建。

图4质粒pET28a-DsbAT-DexT1双酶切鉴定结果。