[发明专利]GFP转染肿瘤细胞的方法在检测肿瘤相关巨噬细胞吞噬功能中的应用

权利要求书

1.一种GFP转染肿瘤细胞的方法在检测肿瘤相关巨噬细胞吞噬功能中的应用；

进一步的，所述应用包括但不限于：

(1)体外筛选药物制剂；

(2)体外筛选吞噬细胞。

2.一种检测肿瘤相关巨噬细胞吞噬功能的方法，其特征在于：利用绿色荧光蛋白GFP稳定转染肿瘤细胞，筛选高表达GFP的肿瘤细胞进行荷瘤实验，实验结束后提取肿瘤相关巨噬细胞直接上机检测。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法具体包括：

工序一：培养肿瘤细胞系，稳定转染GFP，并筛选出具有GFP过表达肿瘤细胞系；

工序二：进行小鼠荷瘤实验，并进行抗肿瘤治疗；

工序三：分离小鼠肿瘤组织，提取肿瘤组织细胞；

工序四：采用流式细胞术上机检测巨噬细胞吞噬功能。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：肿瘤细胞系为BALB/c鼠源性乳腺癌细胞系或卵巢癌细胞系SKOV3；优选为卵巢癌细胞系SKOV3；

当肿瘤细胞系为卵巢癌细胞系SKOV3时，培养基组成为：90％RPMI 1640培养基+10％胎牛血清+1％青-链霉素溶液。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述工序一中，采用嘌呤霉素筛选获得GFP过表达肿瘤细胞系，筛选时间为6-7天，优选为7天；

或，通过免疫荧光显微镜及流式细胞术鉴定转染效率。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述工序二中，选取BALB/C-nude裸鼠成瘤，将5×10⁶个细胞/只引入小鼠体内；

进一步的，荷瘤体积达50-100mm³后，进行后续抗肿瘤治疗。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述工序二中，治疗制剂为具有肿瘤治疗作用的制剂，为化疗、靶向治疗与免疫治疗制剂中的一种或多种，

化疗制剂包括铂类、紫杉醇；

靶向治疗制剂包括贝伐单抗、PARP抑制剂、集落刺激因子1受体-CSF1R抑制剂；

免疫治疗制剂包括PD-1/PD-L1抑制剂；

所述治疗制剂优选为PD-1抑制剂。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述工序二中，实验分为对照组及治疗组，治疗组中治疗制剂的使用量为10-25mg/kg，优选为10mg/kg，每周两次，治疗4周。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述工序三中，待治疗完成后分离小鼠肿瘤组织，具体为：将肿瘤组织剪碎，采用胶原酶消化法分离肿瘤组织细胞；

进一步的，剪碎至1mm³体积后再进行分离肿瘤组织细胞。

进一步的，采用胶原酶IV(1.5mg/ml)+透明质酸酶(0.75mg/ml)+DNA酶(1.1mg/ml)+中性蛋白酶(5U/ml)来分离肿瘤组织细胞。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述工序四中，采用F4/80标记巨噬细胞，F4/80⁺为巨噬细胞，F4/80⁺GFP⁺为吞噬肿瘤细胞的巨噬细胞，F4/80⁺GFP⁺/F4/80⁺即为吞噬比例。