[发明专利]一种锆离子介导的纳米传感器及制备方法和应用

说明书

本公开涉及激酶活性检测技术领域，具体为一种锆离子介导的纳米传感器及制备方法和应用，所述纳米结构包括单量子点QD和捕获探针，链霉亲和素修饰在单量子点QD表面，磷酸基团和生物素各修饰在捕获探针的两端；所述捕获探针利用生物素‑链霉亲和素自组装到单量子点QD表面。在PKA/PNK存在时，他们催化Cy5修饰的肽/DNA磷酸化，并通过Zr⁴⁺与磷酸基团的配位作用组装到单个QD表面，形成QD‑Zr⁴⁺‑Cy5纳米结构并导致QD和Cy5发生荧光共振能量转移(FRET)。通过单分子检测，可以很容易地测量FRET信号。

技术领域

本公开涉及激酶活性检测技术领域，具体为一种锆离子介导的纳米传感器及制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

细胞内磷酸化在信号转导、代谢、基因表达、细胞周期等生物过程中起着重要作用。激酶负责调控磷酸化过程，可分为蛋白激酶(protein kinase，PKA)、T4多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinases，PNK)和小分子激酶。在一个典型的激酶催化的磷酸化过程中，γ-磷酸基团从腺苷-5-三磷酸(ATP)转移到底物的特定位点。PKA和PNK是两类研究最为广泛的激酶。PKA可以通过将γ-磷酸从ATP转移到肽/蛋白质底物中保守的酪氨酸、苏氨酸或丝氨酸残基来催化蛋白质的磷酸化。约30％的人类蛋白受磷酸化调控，PKA的异常表达与各种人类疾病如癌症、免疫缺陷、神经退行性疾病、内分泌失调等密切相关。PNK催化DNA的5'-羟基末端的磷酸化，这对修复DNA链断裂至关重要。PNK的异常表达可诱发多种人类疾病，如布伦氏(Loom)综合症、沃纳(Werner)综合症和色素沉着(Rothmund-Thomson)综合症等。此外，由于PNK抑制剂的积极作用，PNK是潜在的癌症治疗靶点。因此，开发通用的激酶检测生物传感器对疾病的治疗和诊断具有重要意义。

发明人发现，检测激酶活性的传统方法是放射性标记法，该方法利用激酶催化ATP上的放射性磷酸基团(γ-32P)转移到特定的底物肽/DNA的原理实现了激酶的检测。虽然放射性标记法适用于不同底物的激酶检测，但是存在着操作步骤复杂、放射性污染等缺点。近年来，发展了一系列高灵敏度、高特异性的检测方法用来检测PKA和PNK活性。为了检测PKA活性，发展了基于磷酸特异性抗体识别磷酸化底物肽的电化学和荧光分析法，但是这些方法需要昂贵的抗体蛋白，操作过程复杂耗时。另外，也发展了利用生物素修饰的ATP为磷酸供体的荧光方法检测PKA，但是这些分析方法因为需要标记ATP而增加了实验的复杂性和成本。新发展的PNK检测方法主要是通过检测磷酸化的DNA实现PNK的定量分析，这些方法能够与核酸扩增技术结合以提高检测灵敏度。但是这些方法需要设计复杂的DNA探针，并且有着无法避免的非特异性扩增带来的较高的背景信号。另外，由于PNK和PKA的识别底物不同，迄今为止还没有报道过通用的检测激酶活性的生物传感器。因此，开发通用的检测激酶活性的生物传感器对疾病的治疗和诊断具有重要意义。

发明内容

由于PNK和PKA的识别底物不同，迄今为止还没有报道过通用的检测激酶活性的生物传感器，为了解决上述问题，本公开提供了一种锆离子介导的纳米传感器及制备方法和应用，通过开发一种基于锆离子(Zr⁴⁺)介导的单量子点(QD)自组装通用纳米传感器用于检测PKA和PNK活性，分别为PKA和PNK设计了Cy5修饰的底物肽和底物DNA。生物素修饰的捕获探针自组装在QD表面构建纳米传感器。在PKA/PNK存在时，他们催化Cy5修饰的肽/DNA磷酸化，并通过Zr⁴⁺与磷酸基团的配位作用组装到单个QD表面，形成QD-Zr⁴⁺-Cy5纳米结构并导致QD和Cy5发生荧光共振能量转移(FRET)。通过单分子检测，可以很容易地测量FRET信号。

具体地，本公开的技术方案如下所述：