[发明专利]一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基

权利要求书

1.一种去甲四环素高产菌株的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法为将待筛选的去甲四环素菌株通过孔板初筛和摇瓶复筛相结合的方法进行复合筛选，其中孔板初筛结合孔板效价和菌丝形态进行筛选，摇瓶复筛根据菌株效价进行筛选。

2.根据权利要求1所述一种去甲四环素高产菌株的筛选方法，其特征在于：具体包括以下步骤；

A、将待筛选的去甲四环素菌株的菌悬液涂布在固体平板培养基上，分离培养单菌落；

B、单菌落长好后，将同一单菌落孢子分别接种于装有孔板发酵培养基的孔板中和装有斜面培养基的试管中培养；

C、孔板发酵培养结束后，取1mL发酵液经盐酸酸化，酸化后离心，并取上清液检测菌株效价，孔板4℃保存；

D、将步骤C检测得到的高效价菌株对应的孔板发酵液进行菌丝镜检，根据菌丝形态得到复筛菌株，选取与复筛菌株为同一单菌落孢子的B步骤中的斜面菌株接种到摇瓶种子培养基中进行种瓶培养，菌株长好后转接摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；

E、摇瓶发酵培养结束后，发酵液用盐酸酸化，酸化后离心，取上清液检测菌株效价；

F、根据E步骤得到的检测结果，筛选得到去甲四环素高产菌株，并将对应的B步骤中的试管中的斜面菌株制备砂土管保存。

3.根据权利要求1或2所述一种去甲四环素高产菌株的筛选方法，其特征在于：所述待筛选的去甲四环素菌株包括自然分离菌株、物理化学诱变菌株和代谢工程改造菌株；所述物理化学诱变包括紫外线、微波、激光、射线、室温等离子体、亚硝基胍、硫酸二乙酯诱变中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述一种去甲四环素高产菌株的筛选方法，其特征在于：所述D步骤中复筛菌株的菌丝形态呈链丝状。

5.根据权利要求2所述一种去甲四环素高产菌株的筛选方法，其特征在于：所述A步骤中分离培养单菌落的培养条件为：25-30℃，20％-60％湿度条件下培养14-15天；所述B步骤中孔板培养的条件为：25-30℃，20％-60％湿度条件下，220rpm震荡培养2-4天；斜面培养条件为：25-30℃，20％-60％湿度条件下培养14-15天。

6.根据权利要求2所述一种去甲四环素高产菌株的筛选方法，其特征在于：所述步骤D中种瓶培养的条件为：25-30℃，20％-60％湿度条件下，220rpm震荡培养培养36-42h；摇瓶发酵培养的条件为：25-30℃，20％-60％湿度条件下，220rpm震荡培养培养7天。

7.根据权利要求2所述一种去甲四环素高产菌株的筛选方法，其特征在于：所述孔板为12深孔板、24深孔板、48深孔板、96深孔板的任意一种。

8.根据权利要求7所述一种去甲四环素高产菌株的筛选方法，其特征在于：所述孔板为24深孔板，所述24深孔板装量为2-4mL。

9.一种筛选去甲四环素高产菌株的培养基，其特征在于，所述培养基为包括孔板发酵培养基、摇瓶种子培养基和摇瓶发酵培养基的联合培养基。

10.根据权利要求9所述一种筛选去甲四环素高产菌株的培养基，其特征在于：所述孔板发酵培养基的成分及其含量为：可溶性淀粉1.0-4.0％、甘露醇0.1-0.5％、高温豆粉1.0-3.0％、碳酸钙0.5-2.0％、酵母粉0.1-0.5％、大豆蛋白胨0.5-1.5％、硫酸铵0.1-0.5％、L-赖氨酸0.5-1.5％、溴化钠0.1-0.5％、硫酸镁0.01-0.03％、玉米浆0.5-2.0％、消沫剂0.01-0.05％、2-巯基苯并噻唑0.001-0.002％、用硫酸或硝酸调节pH至5.0-6.0，余量用纯水补齐；

所述摇瓶种子培养基的成分及其含量为：玉米淀粉1.0-3.0％、甘露醇0.5-2.0％、高温豆粉0.5-2.5％、碳酸钙0.5-2.0％、酵母浸粉0.1-0.5％、玉米蛋白粉0.5-2.5％、硫酸铵0.1-0.4％、溴化钠0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.01-0.04％、硫酸镁0.01-0.03％、pH自然，余量用纯水补齐；

所述摇瓶发酵培养基的成分及其含量为：玉米淀粉5-10％、甘露醇0.2-1.0％、高温豆粉3.0-6.0％、碳酸钙0.5-2.5％、酵母粉0.1-0.5％、大豆蛋白胨1.0-2.0％、硫酸铵0.1-0.5％、L-赖氨酸0.5-2.5％、溴化钠0.1-0.5％、硫酸镁0.01-0.03％、玉米油(V/V)1.0-4.0％、消沫剂0.01-0.05％、α-淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.05-0.1％、2-巯基苯并噻唑0.001-0.002％、用硫酸或硝酸调节pH至5.0-6.0，余量用纯水补齐。