[发明专利]一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基

说明书

本发明提供了一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基，将待筛选的去甲四环素菌株通过孔板初筛和摇瓶复筛相结合的方法进行复合筛选，缩短了筛选周期，增大了筛选通量。其中孔板初筛结合孔板效价和菌丝形态进行筛选，摇瓶复筛根据菌株效价进行筛选；培养基包括孔板发酵培养基、摇瓶种子培养基和摇瓶发酵培养基。本发明在单菌落接孔板的同时进行了斜面接种，使用接种的斜面进行复试和保菌，减少了菌株的传代次数，另外，孔板初筛选取的效价较高的菌株进行菌丝制片观察，筛选菌丝呈链丝状的菌株进行摇瓶复试，去除了大部分假性高产菌株，提高了高产菌株的筛选几率，减少了复试的工作量。

技术领域

本发明属于微生物育种和生物技术领域，具体涉及一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基。

背景技术

去甲四环素是合成米诺环素、替加环素等第二、三代四环类抗耐药菌药物的重要中间体，也是合成四环类新药不可或缺的前体。目前，去甲四环素的生产方法主要是以去甲金霉素为原料化学合成而得，而发酵法生产研究较少。因此，筛选去甲四环素的高产菌株具有重要的工业应用价值。

工业上获得优良菌种的方法包括自然分离法、诱变选育法、代谢工程改造法等。但是，无论采用哪一种菌种改造方法，都离不开菌株筛选的过程。而筛选菌株是一个随机事件，只有筛选菌株的基数足够大，获得优良菌种的几率才能大。所以，传统的微生物育种方法是一项繁重的工作，往往工作量大，周期长，效率低。高通量筛选可以大大提高筛选通量，但是孔板筛选得到的高产菌株，高产性能不易重复，复试时高出比往往又大幅降低，生产水平不高。鉴于此，本发明开发了一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基。

发明内容

为了解决去甲四环素高产菌株筛选周期长、工作量大等难题，本发明提供了一种去甲四环素高产菌株的筛选方法及培养基。

本发明采用的技术方案为：

一种去甲四环素高产菌株的筛选方法，所述筛选方法为将待筛选的去甲四环素菌株通过孔板初筛和摇瓶复筛相结合的方法进行复合筛选，其中孔板初筛结合孔板效价和菌丝形态进行筛选，摇瓶复筛根据菌株效价进行筛选。

进一步地，具体包括以下步骤；

A、将待筛选的去甲四环素菌株的菌悬液涂布在固体平板培养基上，分离培养单菌落；

B、单菌落长好后，将同一单菌落孢子分别接种于装有孔板发酵培养基的孔板中和装有斜面培养基的试管中培养；

C、孔板发酵培养结束后，取1mL发酵液经盐酸酸化，酸化后离心，并取上清液检测菌株效价，孔板4℃保存；

D、将步骤C检测得到的高效价菌株对应的孔板发酵液进行菌丝镜检，根据菌丝形态得到复筛菌株，选取与复筛菌株为同一单菌落孢子的B步骤中的斜面菌株接种到摇瓶种子培养基中进行种瓶培养，菌株长好后转接摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；

E、摇瓶发酵培养结束后，发酵液用盐酸酸化，酸化后离心，取上清液检测菌株效价；

F、根据E步骤得到的检测结果，筛选得到去甲四环素高产菌株，并将对应的B步骤中的试管中的斜面菌株制备砂土管保存。

进一步地，所述待筛选的去甲四环素菌株包括自然分离菌株、物理化学诱变菌株和代谢工程改造菌株；所述物理化学诱变包括紫外线、微波、激光、射线、室温等离子体、亚硝基胍、硫酸二乙酯诱变中的一种或多种。

进一步地，所述D步骤中复筛菌株的菌丝形态呈链丝状。

进一步地，所述A步骤中分离培养单菌落的培养条件为：25-30℃， 20％-60％湿度条件下培养14-15天；所述B步骤中孔板培养的条件为：25-30℃，20％-60％湿度条件下，220rpm震荡培养2-4天；斜面培养条件为：25-30℃，20％-60％湿度条件下培养14-15天。