[发明专利]一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法

权利要求书

1.一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，其特征在于，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；

所述引物序列为如下核苷酸序列：

P1：SEQ ID NO：1；

P2：SEQ ID NO：2；

P3：SEQ ID NO：3；

P4：SEQ ID NO：4。

2.根据权利要求1所述的一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，其特征在于，包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L Mg²⁺溶液3.5μL，40μmol/L P1、P2混合物0.7μL，40μmol/L P3、P4混合物0.3μL，JEV cDNA1μL、PPV DNA1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，ddH₂O 11.6μL，其中JEV cDNA是JEV抽提后的RNA经过反转录后得到的cDNA。

3.一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV试剂的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)PPV的NS1基因和JEV的NS1基因序列的选择：从GenBank数据库中下载已经发表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列；

(2)根据选择的PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的靶序列，用PCR引物设计软件分别进行引物的设计，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，得到2最佳引物：P1、P2及P3、P4，用全自动DNA合成仪进行引物的合成，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；

所述引物序列为如下核苷酸序列：

P1：SEQ ID NO：1；

P2：SEQ ID NO：2；

P3：SEQ ID NO：3；

P4：SEQ ID NO：4。

4.一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

(1)样品的处理；

(2)病料样品RNA/DNA的提取；

(3)二联PCR反应：

采用25μL PCR反应体系；PCR反应体系的组成为：包括10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/LdNTP 4μL，25mmol/L Mg²⁺溶液3.5μL，40μmol/L P1、P2混合物0.7μL，40μmol/L P3、P4混合物0.3μL，JEV cDNA1μL、PPV DNA1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，去ddH₂O 11.6μL；PCR反应条件为：95.5℃，预变性5min；95℃，变性30s；53.3℃，退火30s；72℃，延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸5min，其中JEV cDNA是JEV抽提后的RNA经过反转录后得到的cDNA；

(4)结果判定

取二联PCR产物在琼脂糖凝胶上，电泳后在凝胶成像系统中观察拍照，以标准DNAmarker(D,L-2000)作参考；电泳后，若琼脂糖凝胶中同时出现2条核酸带，且片段大小分别为750bp和475bp，说明病料样品中同时含有PRV、JEV病毒；如果仅出现其中一个对应长度的核酸片段，则表明病料样品中只含有其中一种病毒；若不出现任何核酸片段，则表明病料样品中不含有PRV、JEV病毒。

5.根据权利要求4所述的一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的方法，其特征在于，步骤(4)中，取5μl产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳30min后在凝胶成像系统中进行观察。

6.根据权利要求4所述的一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的方法，其特征在于，步骤(3)中，JEV的cDNA的合成反应体系：5×PrimeScript^TM缓冲液2μL，PrimeScript^TMRT-EnzymeMix I 0.5μL，40μmol/L Specific down primer 0.25μL，总RNA 2μL，RNase Free ddH₂O5.52μL。