[发明专利]一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法

说明书

本发明公开了一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；所述引物序列为如下核苷酸序列：P1：SEQ ID NO：1；P2：SEQ ID NO：2；P3：SEQ ID NO：3；P4：SEQ ID NO：4。本发明一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，具有快速、特异性强等优点，通过联合PCR技术可以快速、有效地鉴别PPV、JEV两种混合病毒，与单一PCR检测相比，具有省时、省力的优点。

技术领域

本发明涉及检测试剂领域，具体涉及一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法。

背景技术

猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的一种猪的繁殖障碍病。以怀孕母猪发生流产、死产、产木乃伊为特征。猪流行性乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒(JEV)引起的猪繁殖障碍性疾病，主要以母猪流产、死胎和公猪睾丸炎为特征。在种猪场发生的繁殖障碍性疫病中，这两种疾病繁殖障碍性疾病往往会严重降低种猪的生产效率。生产上对种猪场繁殖障碍性疾病的摸底排查、临床诊断，为猪场制定免疫程序提供科学的理论依据具有重大的实践意义。目前对本病的诊断目前主要是PCR和血清学诊断方法。但是血清学方法不如PCR方法敏感性高，PCR方法大多都是单一PCR检测，要检测这两种病毒的混合感染需要分别进行 PCR操作，因此相对比较繁琐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有检测PPV、JEV两种病毒混合感染的方法为分别进行单一PCR检测操作，相对比较繁琐，目的在于提供一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，可在同一体系中检测两种感染病毒的存在，能够大大的提高诊断效率。

本发明通过下述技术方案实现：

一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的 NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp， P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；所述引物序列为如下核苷酸序列：P1：SEQ ID NO：1；5'-GGGACCAGGCAACAGACAT-3'；

P2：SEQ ID NO：2；5'-CTGCGGTTTGAGCCATCA-3'；

P3：SEQ ID NO：3；5'-AGGCATCACATCAACCCG-3'；

P4：SEQ ID NO：4：5'-AAGGGAGCAACTGCGACA-3'。

一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，包括10×PCR缓冲液2.5μL， 2.5mmol/LdNTP 4μL，25mmol/L Mg²⁺溶液3.5μL，40μmol/L P1、P2混合物0.7μL，40μmol/L P3、P4混合物0.3μL，JEV cDNA1μL、PPV DNA1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，ddH₂O 11.6μL，其中JEVcDNA是JEV抽提后的RNA经过反转录后得到的cDNA。

一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV试剂的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)PPV的NS1基因和JEV的NS1基因序列的选择：从GenBank数据库中下载已经发表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列，