[发明专利]一种用于快速鉴别比较农田黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法

权利要求书

1.快速鉴别比较农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）用察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养待测土壤样品，制备待鉴别土壤样品的待测液，备用；

（2）采用间接非竞争双抗体夹心法鉴别比较农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度，步骤包括：

a待测液加入到孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，反应，洗板；

b加入黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01多克隆抗体反应，洗板；

c加入与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体，反应，洗板；

d加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果；

（3）通过比较AFT-YJFZ01浓度，得知农田土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度，即丰度强弱次序——测定的AFT-YJFZ01浓度与土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度呈现正相关关系，即测定的AFT-YJFZ01浓度越高，则土壤中黄曲霉毒素的产毒真菌相对丰度越高，该土壤样品对应的农田的产毒真菌发生风险越高；

所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子是指AFT-YJFZ01肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1 所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用系列浓度的起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01纯品溶液，替换待测液，用于制作标准曲线，计算得到待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的用察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养待测土壤样品并制备待鉴别土壤样品的待测液，其方法步骤为：称量待测的土壤样品，转移至样品稀释液中，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液，取 10-1000 µL上述待测样品均匀分散液，加在含6-600 mL常规察氏液体培养基中，置于15~ 35°C下200 ±50rpm震荡培养，培养6-24 h后取样，形成待鉴别土壤样品的待测液。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的样品稀释液是指含有0.1%山梨醇和0.1%绵糖的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板，其制备方法为：将AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体溶解在ELISA包被缓冲液中，形成0.2-8.0 μg/mL的包被液，再加入至酶标板中，4 ℃放置过夜或者37 ℃放置不少于2 h后，去除上述酶标板中包被液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板；然后加ELISA常规封闭液，放置室温或37 ℃封闭不少于1 h后，再弃去封闭液，再用ELISA常规洗液洗涤酶标板。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）的具体步骤为：

a将上述待测液，以每孔100-200 μL加入到孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板孔中，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，

b然后加入AFT-YJFZ01兔源多克隆抗体，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板，

c然后加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，放置室温或37 ℃反应不少于1 h后，弃去液体，再洗涤酶标板，

d然后先后加入显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中AFT-YJFZ01的浓度。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的多克隆抗体与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子AFT-YJFZ01的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的显色液是指ELISA常规的双氧水与TMB显色液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的终止液是指ELISA常规的显色终止液：2mol/L硫酸水溶液。