[发明专利]一种构建基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高ε-聚赖氨酸产量的方法与应用

权利要求书

1.一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH(Streptomycesdiastatochromogenes MDH)，其特征在于：过表达的基因序列与SEQ No.1有90％以上的相似性。

2.一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其特征在于：其构建步骤如下：

⑴提取大肠杆菌JM109转化子中的重组质粒pIMEP-MDH，首先将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，涂布于含有25μg/mL卡那霉素、50μg/mL安普霉素和25μg/mL氯霉素的LB平板中，挑选阳性转化子于含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素三种抗生素的LB液体培养基中，37℃恒温震荡过夜培养，之后转接至含有相同浓度的卡那霉素、安普霉素和氯霉素抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.4至0.6之间，离心收集菌体，再用新鲜的LB液体培养基洗涤菌体除去残余抗生素，重悬至LB液体培养基中置于冰上备用；

⑵向贝纳特培养基上产孢的淀粉酶产色链霉菌TUST(Streptomycesdiastatochromogenes TUST)菌株平板上加入pH 8.0的TES缓冲液，刮下淀粉酶产色链霉菌TUST孢子，倒入盛有玻璃珠的容器中，30℃，180r/min振荡打断孢子链，无菌脱脂棉过滤除去菌丝，收集孢子悬液，50℃水浴热激10min，立即将孢子悬液冷却至室温后加入M3G培养基，于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发，5000r/min离心5min收集萌发孢子，用TES缓冲液重悬萌发孢子备用；

⑶将步骤⑴的阳性转化子大肠杆菌和步骤⑵萌发的淀粉酶产色链霉菌TUST的孢子等体积混合，均匀涂布于含有5mM MgCl₂的SFM培养基上，30℃倒置培养14-18h后，用含25μL萘啶酮酸(浓度为25mg/mL)及25μL安普霉素(浓度为25mg/mL)的1ml无菌水对平板进行覆盖，吹干平板后继续倒置培养3-5天，挑选阳性结合子单克隆，得到基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH。

3.根据权利要求2所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其特征在于：所述步骤⑵中淀粉酶产色链霉菌TUST为菌种保藏号CGMCC No.3145的菌种。

4.根据权利要求2所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌MDH，其特征在于：所述步骤⑵中每1LM3G培养基组成为：

(NH₄)₂SO₄10 g/L，KH₂PO₄1.36 g/L，K₂HPO₄0.8 g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水补充至1L；

或者，每1L贝纳特培养基的组成为：

葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂15-20g，加水补充至1L，NaOH调pH7.7；

或者，所述步骤⑶中每1L SFM培养基的组成为：

黄豆饼粉30g，甘露醇20g、琼脂粉20g，加水补充至1L，用NaOH调节pH 7.2～7.4；

其中，所述黄豆饼粉经过如下处理后使用：

加入900mL自来水，煮沸半小时后用八层纱布过滤。